變性高效液相色譜技術(shù)定量檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變方法學(xué)的建立

陳建蘭，李慶山△，王漢平，應(yīng) 逸，杜慶華，許艷麗，陳曉燕，謝健晉，毛 平，李志鵬

(1廣州醫(yī)學(xué)院附屬市一人民醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510180;2廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

在急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)分層治療的研究中，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)基因近膜區(qū)的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication，ITD)是最早被識(shí)別的分子標(biāo)記之一，其存在與否被認(rèn)為對(duì)AML的預(yù)后具有重要的判斷價(jià)值。有研究認(rèn)為[1，2]，F(xiàn)LT3-ITD的這種預(yù)測(cè)價(jià)值與突變等位基因的比例有關(guān)，疾病復(fù)發(fā)率(relapse rate，RR)、無病生存率(disease-free survival，DFS)和總體生存期(overall survival，OS)隨著突變比例的升高均有惡化趨勢(shì)，且高白細(xì)胞也在高突變比例中更加突出，高比例突變的FLT3-ITD預(yù)測(cè)價(jià)值顯得更大，因而定量分析FLT3-ITD尤為重要。通常情況下由于毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)的高效性和高敏感性，F(xiàn)LT3-ITD相對(duì)定量分析主要是采用此法[3]。變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)已經(jīng)用于檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變[4]，且技術(shù)方法穩(wěn)定可靠，而少見DHPLC用于檢測(cè)FLT3-ITD，故我們嘗試運(yùn)用DHPLC技術(shù)建立相對(duì)定量檢測(cè)FLT3-ITD突變比例的方法，對(duì)121例臨床病例進(jìn)行檢測(cè)，并與CE分析結(jié)果進(jìn)行了比較，最后對(duì)比測(cè)序結(jié)果。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象 為患者，共121例，其中40例來自2007年1月-2010年12月我院住院或門診初治經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型并參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]確診為原發(fā)性 AML病例，其余81例來自2007年1月-2010年12月廈門大學(xué)中山醫(yī)院與第一附屬醫(yī)院的住院或門診初治同上確診為AML病例，由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。其中M111例，M235例，M335例，M49例，M526例，M64例，M71例;男59例，女62例;中位年齡35(16-77)歲。陰性對(duì)照為10例健康人群。

1.2 主要試劑 EZHighTMDNA kit購自Texas BioGene。5×buffer溶液(含 2.5 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L Mg2+)和無RNase H2O均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司;10×LCGreen plus dye、Hotstart polymerase均為 Qiagen產(chǎn)品;FLT3-ITD正反向引物參照NCBI設(shè)計(jì)，由TaKaRa大連寶生物工程有限公司合成。DHPLC流動(dòng)液:三乙胺乙酰鹽(TEAA)和乙腈(ACN)均購自Transgenomic。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 原保存的固定后的骨髓樣本用EZHighTMDNA kit提取樣本DNA，具體操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值確定DNA產(chǎn)物的濃度。將提取的DNA置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增 針對(duì)FLT3-ITD突變主要發(fā)生在14號(hào)外顯子上，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為328 bp，正向引物5'-AGC AAT TTA GGT ATG AAA GCC AGC TA-3'，反向引物 5'-GGT TGC CGT CAA AAT GCT GAA AG-3'。反應(yīng)體系組成為:5× buffer 5.0 μL;正向引物(10 μmol/L):0.5 μL;反向引物(10 μmol/L):0.5 μL;Hotstart polymerase 1.0 μL，DNA 2.0 μL(根據(jù)濃度調(diào)到50-100 ng);加無RNA酶水至體積25 μL。上ABI Veriti PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)29次。72 ℃延伸7 min，1個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置95℃變性5 min，然后降溫至25℃ 1 min，這時(shí)混合樣品中就會(huì)形成同源和異源的雙鏈。

2.3 DHPLC分析 上WAVE 3500型分析儀前先配流動(dòng)液:Buffer A液(0.1 mol/L TEAA):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 μL ACN(乙腈)再加HPLC純水定容至1 L。Buffer B液(0.1 mol/L TEAA，含25%ACN):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 mL ACN再加HPLC純水定容至1 L。將變性后的PCR產(chǎn)物放入到WAVE 3500型分析儀96孔樣品池上，在50℃的條件下分析待測(cè)樣本。根據(jù)程序指令，進(jìn)樣器自動(dòng)吸取15 μL PCR產(chǎn)物，注人DNASep分離柱內(nèi)，被流動(dòng)相以0.9 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，在260 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值。經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)處理后，形成DHPLC峰形圖譜，結(jié)果被自動(dòng)存儲(chǔ)，供分析鑒定。每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

正常人基因組和FLT3-ITD野生型標(biāo)本DHPLC分析時(shí)表現(xiàn)為單1洗脫峰，突變型樣本則表現(xiàn)為2個(gè)或3個(gè)洗脫峰。與標(biāo)準(zhǔn)參考模板對(duì)比，通過觀察異源雙鏈洗脫峰出現(xiàn)與否，確定突變存在的情況;然后通過對(duì)洗脫峰的峰面積進(jìn)行計(jì)算，獲得突變等位基因的比例，計(jì)算公式:

2.4 CE方法分析 在廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，首先也是針對(duì)FLT3-ITD基因突變多發(fā)生在14外顯子上設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為367 bp。摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，25 μL 反應(yīng)體系含5 μL 10 ×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq HS DNA聚合酶，正反向引物(各自均為150 nmol/L)和5 μL gDNA模板。在T3 Thermocycler上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下:95℃預(yù)變性3 min;18個(gè)循環(huán)的Touchdown PCR，程序?yàn)?5℃ 30 s，61℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)下降0.5℃)，72℃ 40 s;17個(gè)循環(huán)的普通PCR，程序?yàn)?5℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s;72℃ 7 min。

后取1 μL PCR產(chǎn)物(用去離子水稀釋50-200倍)、16.5 μL去離子甲酰胺(SLS)、2.5 μL 熒光標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)(CEQ 600 size standard mixture，Beckman Coulter，p/n 608095，用SLS稀釋10倍)混勻后，轉(zhuǎn)移到96孔加樣板，并滴加1滴石蠟油防止揮發(fā)。在CEQ8800遺傳分析系統(tǒng)上，采用“Frag-2”程序運(yùn)行，程序進(jìn)行自動(dòng)化操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)儀器自帶軟件進(jìn)行“Fragment Analysis”，對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行片段分析，確定是否存在FLT3-ITD突變。正常人基因組DNA標(biāo)本和野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰。突變型標(biāo)本除在367 bp處出現(xiàn)單峰外，在367 bp后將出現(xiàn)另一峰，根據(jù)軟件給出的野生型峰面積S1和突變型峰面積S2，按照以下公式來計(jì)算突變比例，計(jì)算公式:

FLT3-ITD突變比例(%)=S2/(S1+S2)×100%。

2.5 DNA測(cè)序 將所有樣品DNA送北京六合華大基因科技有限公司擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證;再將測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件分析并與NCBI網(wǎng)上的FLT3基因進(jìn)行比對(duì)確定基因突變情況;最后與2種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組計(jì)量資料均數(shù)比較采用隨機(jī)配對(duì)設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)，假定差值服從正態(tài)分布。

結(jié) 果

1 AML患者DHPLC分析結(jié)果

121例患者樣本中有108例樣本擴(kuò)增后進(jìn)行分析出現(xiàn)單1洗脫峰，為FLT3-ITD野生型，121例中(4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、28 號(hào)、79號(hào)、85號(hào)、93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和118號(hào))有2個(gè)或3個(gè)洗脫峰，即為FLT3-ITD突變型的樣本，見圖1，總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對(duì)應(yīng)的公式計(jì)算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本3次實(shí)驗(yàn)所得突變比例間無顯著差異，取平均值。得出13例陽性樣本突變等位基因的比例不一，分布范圍中位數(shù)34.0%(12.4%-87.0%)，見表1。正常對(duì)照的10例健康人群PCR產(chǎn)物的DHPLC洗脫峰也全為單1峰。

2 AML患者CE分析結(jié)果

正常對(duì)照健康成人DNA標(biāo)本進(jìn)行CE的片段分析結(jié)果在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰。121例AML標(biāo)本中108例在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰，為FLT3-ITD野生型;13例除367 bp處峰之外在367 bp后出現(xiàn)額外峰，為FLT3-ITD突變型(見121例樣本中4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、28號(hào)、79號(hào)、85號(hào)，93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和 118號(hào))，見圖 2，總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對(duì)應(yīng)的公式計(jì)算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)所得突變比例間無顯著差異，取平均值。13例陽性樣本間比較突變等位基因的比例不一，分布范圍中位數(shù)為34.5%(11.4%-80.2%)，見表1。

Figure1.The DHPLC characteristic elution peaks.From top to bottom:represent sample of wildtype FLT3-ITD;the 28th sample:FLT3-ITD mutation in the low percentage(12.4%);the 8th sample:FLT3-ITD mutation in the moderate percentage(42.3%);the 7th sample:FLT3-ITD mutation in the high proportion(87.0%).圖1 DHPLC的特征性洗脫峰

表1 DHPLC和CE定量分析FLT3-ITD突變陽性樣本的結(jié)果對(duì)比Table1.The quantitative analysis of FLT3-ITD mutation in positive samples examined with DHPLC and CE methods(%.the average for three repeative experiments)

3 2種方法結(jié)果對(duì)比

2種方法陽性定性結(jié)果吻合，陽性率是一樣的。2種方法陽性定量結(jié)果之間比較也無顯著差異(P＞0.05)。

參照文獻(xiàn)[1]，我們將突變比例分成3組。低突變 (＜25%)有5例，中突變(≥25%且≤50%)有5例，高突變 (＞50%)有3例。

4 測(cè)序驗(yàn)證

將所得樣品進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào)，28號(hào)、79號(hào)、85號(hào)，93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和 118號(hào)樣品為單個(gè)串聯(lián)重復(fù)突變，插入片段大小為21-87 bp不等，均為單個(gè)插入片段。結(jié)果與DHPLC、CE檢測(cè)到的陽性結(jié)果吻合。其余108例為FLT3-ITD陰性。

討 論

AML分層治療是近年來研究的熱點(diǎn)，染色體核型異常的AML病例可按照WHO的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分層管理，而占原發(fā)病例40%-50%的核型正常的中間型病例具有高度異質(zhì)性，目前尚缺乏足夠分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行精細(xì)的分層管理和準(zhǔn)確的預(yù)后判斷[6]。作為最早被發(fā)現(xiàn)具有不良預(yù)后判斷價(jià)值的的分子指標(biāo)之一，F(xiàn)LT3-ITD的研究最為廣泛，早幾年國(guó)內(nèi)外針對(duì)FLT3-ITD定性研究較多。尹列芬等[7]已用DHPLC技術(shù)定性檢測(cè)了60例AML患者FLT3-ITD基因突變情況，認(rèn)為FLT3-ITD基因突變可作為預(yù)測(cè)AML預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。而目前這種預(yù)測(cè)價(jià)值探索深入化，有些研究者認(rèn)為FLT3-ITD等位基因突變水平的不同，預(yù)后也不同;比尹列芬他們單純的定性研究更具有預(yù)后判斷價(jià)值。比如有一項(xiàng)采用CE的方法[1]的研究以FLT3-ITD突變等位基因水平和FLT3-ITD存在與否作為分組指標(biāo)，比較分析了2組病例RR、DFS和OS，顯示前者的預(yù)測(cè)作用明顯強(qiáng)于后者，差異極顯著:隨著FLT3-ITD突變比例的增加，患者的RR也隨之增加，DFS和OS降低，預(yù)后則變差;低突變水平(﹤25%)患者的預(yù)后較野生型患者差，中度突變水平(25%-50%)患者的預(yù)后又較低突變水平患者差，高度突變水平(﹥50%)患者的預(yù)后最差。Bullinger等[8]研究提示對(duì)FLT3-ITD突變等位基因進(jìn)行定量分析，有可能對(duì)AML進(jìn)行更精細(xì)的治療分層和更準(zhǔn)確的預(yù)后判斷。不過Thiede等[2]則認(rèn)為，F(xiàn)LT3-ITD低突變水平患者的預(yù)后與野生型患者相比并無差別，只有高水平的FLT3-ITD突變才具有預(yù)后判斷價(jià)值。

Figure2.The analysis result of one sample using CE method.圖2 某一樣品的CE方法分析結(jié)果

所以定量檢測(cè)FLT3-ITD對(duì)日后詳細(xì)判斷正常核型AML患者預(yù)后及指導(dǎo)治療具有更重要的意義。但是目前多用上述的CE方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)儀器設(shè)備要求高或技術(shù)方法上繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速判斷，為進(jìn)一步探討FLT3-ITD突變等位基因水平的臨床價(jià)值，我們根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件，在DHPLC定性檢測(cè)基因突變功能的基礎(chǔ)上對(duì)FLT3-ITD突變等位基因進(jìn)行定量檢測(cè)。它是一項(xiàng)敏感可靠的DNA分析技術(shù)[9]。FLT3-ITD基因突變運(yùn)用該法的檢測(cè)是基于異源雙鏈的形成，根據(jù)PCR產(chǎn)物變性復(fù)性后，形成了同源雙鏈和異源雙鏈，而異源雙鏈由于堿基對(duì)不匹配，在部分變性的溫度條件下，會(huì)在不匹配的堿基對(duì)處形成部分解鏈。由于單鏈DNA帶負(fù)電荷減少，結(jié)合力弱，因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來。根據(jù)其在柱子上保留時(shí)間的不同，可將同源雙鏈和異源雙鏈分離。如此就可分離檢測(cè)出由于ITD的插入而引起的FLT3基因長(zhǎng)度多態(tài)性，再通過對(duì)洗脫峰面積的計(jì)算，對(duì)FLT3-ITD突變等位基因即可進(jìn)行定量分析。

應(yīng)用該方法，我們成功地對(duì)121例AML樣本進(jìn)行了檢測(cè)分析，對(duì)13例突變陽性的樣本進(jìn)行了定量計(jì)算。為驗(yàn)證DHPLC定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們采用CE的方法對(duì)樣本重復(fù)進(jìn)行了分析。從表1可知，2種方法定量的結(jié)果完全一致(P＞0.05)，表明本研究的DHPLC定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定。而本組的研究群體中，F(xiàn)LT3-ITD突變的陽性率只有10.7%(13/121)，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的AML中20%-30%的陽性檢出率，正常核型AML中30%-40%[9]。而這較低的陽性率可能與樣本數(shù)量有限、地域分布局限性有關(guān)。而且，目前有研究認(rèn)為FLT3-ITD定量結(jié)果不同，預(yù)后比較有顯著差異，當(dāng)然，這有待我們后續(xù)進(jìn)一步研究。

與以往多數(shù)采用的CE方法檢測(cè)FLT3基因突變情況相比，DHPLC除具有同CE方法一樣快速、高重復(fù)性、自動(dòng)化、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)外，且具有高通量、快捷、成本相對(duì)低的特點(diǎn)[10]。它不需要熒光標(biāo)記的引物，也不需要任何PCR純化，簡(jiǎn)化了操作步驟。經(jīng)我們對(duì)比觀察，DHPLC方法檢測(cè)1個(gè)樣品所花時(shí)間不足CE方法的一半，而我們的研究又證實(shí)DHPLC的結(jié)果與CE的結(jié)果一致，更進(jìn)一步證實(shí)了DHPLC方法的可行性和實(shí)效性。雖然突變比例極高時(shí)該法不如CE精確，但計(jì)算軟件中的切割峰功能能使計(jì)算結(jié)果達(dá)到較高精確性，且并不影響對(duì)高突變比例樣本界限的判定。

綜上所述，建立DHPLC技術(shù)相對(duì)定量檢測(cè)FLT3-ITD突變情況，能為急性髓細(xì)胞白血病臨床治療與預(yù)后提供了更詳盡的參考指標(biāo)。

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