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    變性高效液相色譜技術(shù)定量檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變方法學(xué)的建立

    2011-08-02 13:04:58陳建蘭李慶山王漢平杜慶華許艷麗陳曉燕謝健晉李志鵬
    中國(guó)病理生理雜志 2011年9期
    關(guān)鍵詞:雙鏈等位基因比例

    陳建蘭,李慶山△,王漢平,應(yīng) 逸,杜慶華,許艷麗,陳曉燕,謝健晉,毛 平,李志鵬

    (1廣州醫(yī)學(xué)院附屬市一人民醫(yī)院血液科,廣東 廣州 510180;2廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361005)

    在急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)分層治療的研究中,F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,F(xiàn)LT3)基因近膜區(qū)的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication,ITD)是最早被識(shí)別的分子標(biāo)記之一,其存在與否被認(rèn)為對(duì)AML的預(yù)后具有重要的判斷價(jià)值。有研究認(rèn)為[1,2],F(xiàn)LT3-ITD的這種預(yù)測(cè)價(jià)值與突變等位基因的比例有關(guān),疾病復(fù)發(fā)率(relapse rate,RR)、無病生存率(disease-free survival,DFS)和總體生存期(overall survival,OS)隨著突變比例的升高均有惡化趨勢(shì),且高白細(xì)胞也在高突變比例中更加突出,高比例突變的FLT3-ITD預(yù)測(cè)價(jià)值顯得更大,因而定量分析FLT3-ITD尤為重要。通常情況下由于毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)的高效性和高敏感性,F(xiàn)LT3-ITD相對(duì)定量分析主要是采用此法[3]。變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)已經(jīng)用于檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變[4],且技術(shù)方法穩(wěn)定可靠,而少見DHPLC用于檢測(cè)FLT3-ITD,故我們嘗試運(yùn)用DHPLC技術(shù)建立相對(duì)定量檢測(cè)FLT3-ITD突變比例的方法,對(duì)121例臨床病例進(jìn)行檢測(cè),并與CE分析結(jié)果進(jìn)行了比較,最后對(duì)比測(cè)序結(jié)果。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 研究對(duì)象 為患者,共121例,其中40例來自2007年1月-2010年12月我院住院或門診初治經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型并參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]確診為原發(fā)性 AML病例,其余81例來自2007年1月-2010年12月廈門大學(xué)中山醫(yī)院與第一附屬醫(yī)院的住院或門診初治同上確診為AML病例,由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。其中M111例,M235例,M335例,M49例,M526例,M64例,M71例;男59例,女62例;中位年齡35(16-77)歲。陰性對(duì)照為10例健康人群。

    1.2 主要試劑 EZHighTMDNA kit購自Texas BioGene。5×buffer溶液(含 2.5 mmol/L dNTPs,2.5 mmol/L Mg2+)和無RNase H2O均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司;10×LCGreen plus dye、Hotstart polymerase均為 Qiagen產(chǎn)品;FLT3-ITD正反向引物參照NCBI設(shè)計(jì),由TaKaRa大連寶生物工程有限公司合成。DHPLC流動(dòng)液:三乙胺乙酰鹽(TEAA)和乙腈(ACN)均購自Transgenomic。

    2 方法

    2.1 基因組DNA提取 原保存的固定后的骨髓樣本用EZHighTMDNA kit提取樣本DNA,具體操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值確定DNA產(chǎn)物的濃度。將提取的DNA置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 PCR擴(kuò)增 針對(duì)FLT3-ITD突變主要發(fā)生在14號(hào)外顯子上,設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為328 bp,正向引物5'-AGC AAT TTA GGT ATG AAA GCC AGC TA-3',反向引物 5'-GGT TGC CGT CAA AAT GCT GAA AG-3'。反應(yīng)體系組成為:5× buffer 5.0 μL;正向引物(10 μmol/L):0.5 μL;反向引物(10 μmol/L):0.5 μL;Hotstart polymerase 1.0 μL,DNA 2.0 μL(根據(jù)濃度調(diào)到50-100 ng);加無RNA酶水至體積25 μL。上ABI Veriti PCR擴(kuò)增儀,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72℃ 1 min,循環(huán)29次。72 ℃延伸7 min,1個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置95℃變性5 min,然后降溫至25℃ 1 min,這時(shí)混合樣品中就會(huì)形成同源和異源的雙鏈。

    2.3 DHPLC分析 上WAVE 3500型分析儀前先配流動(dòng)液:Buffer A液(0.1 mol/L TEAA):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 μL ACN(乙腈)再加HPLC純水定容至1 L。Buffer B液(0.1 mol/L TEAA,含25%ACN):50 mL 2 mmol/L TEAA+250 mL ACN再加HPLC純水定容至1 L。將變性后的PCR產(chǎn)物放入到WAVE 3500型分析儀96孔樣品池上,在50℃的條件下分析待測(cè)樣本。根據(jù)程序指令,進(jìn)樣器自動(dòng)吸取15 μL PCR產(chǎn)物,注人DNASep分離柱內(nèi),被流動(dòng)相以0.9 mL/min的流速進(jìn)行洗脫,在260 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值。經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)處理后,形成DHPLC峰形圖譜,結(jié)果被自動(dòng)存儲(chǔ),供分析鑒定。每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

    正常人基因組和FLT3-ITD野生型標(biāo)本DHPLC分析時(shí)表現(xiàn)為單1洗脫峰,突變型樣本則表現(xiàn)為2個(gè)或3個(gè)洗脫峰。與標(biāo)準(zhǔn)參考模板對(duì)比,通過觀察異源雙鏈洗脫峰出現(xiàn)與否,確定突變存在的情況;然后通過對(duì)洗脫峰的峰面積進(jìn)行計(jì)算,獲得突變等位基因的比例,計(jì)算公式:

    2.4 CE方法分析 在廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成,首先也是針對(duì)FLT3-ITD基因突變多發(fā)生在14外顯子上設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為367 bp。摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,摸索反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,25 μL 反應(yīng)體系含5 μL 10 ×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3,500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2),0.2 mmol/L dNTPs,1 U Taq HS DNA聚合酶,正反向引物(各自均為150 nmol/L)和5 μL gDNA模板。在T3 Thermocycler上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,程序如下:95℃預(yù)變性3 min;18個(gè)循環(huán)的Touchdown PCR,程序?yàn)?5℃ 30 s,61℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)下降0.5℃),72℃ 40 s;17個(gè)循環(huán)的普通PCR,程序?yàn)?5℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 40 s;72℃ 7 min。

    后取1 μL PCR產(chǎn)物(用去離子水稀釋50-200倍)、16.5 μL去離子甲酰胺(SLS)、2.5 μL 熒光標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)(CEQ 600 size standard mixture,Beckman Coulter,p/n 608095,用SLS稀釋10倍)混勻后,轉(zhuǎn)移到96孔加樣板,并滴加1滴石蠟油防止揮發(fā)。在CEQ8800遺傳分析系統(tǒng)上,采用“Frag-2”程序運(yùn)行,程序進(jìn)行自動(dòng)化操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,根據(jù)儀器自帶軟件進(jìn)行“Fragment Analysis”,對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行片段分析,確定是否存在FLT3-ITD突變。正常人基因組DNA標(biāo)本和野生型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰。突變型標(biāo)本除在367 bp處出現(xiàn)單峰外,在367 bp后將出現(xiàn)另一峰,根據(jù)軟件給出的野生型峰面積S1和突變型峰面積S2,按照以下公式來計(jì)算突變比例,計(jì)算公式:

    FLT3-ITD突變比例(%)=S2/(S1+S2)×100%。

    2.5 DNA測(cè)序 將所有樣品DNA送北京六合華大基因科技有限公司擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證;再將測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件分析并與NCBI網(wǎng)上的FLT3基因進(jìn)行比對(duì)確定基因突變情況;最后與2種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組計(jì)量資料均數(shù)比較采用隨機(jī)配對(duì)設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn),假定差值服從正態(tài)分布。

    結(jié) 果

    1 AML患者DHPLC分析結(jié)果

    121例患者樣本中有108例樣本擴(kuò)增后進(jìn)行分析出現(xiàn)單1洗脫峰,為FLT3-ITD野生型,121例中(4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、28 號(hào)、79號(hào)、85號(hào)、93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和118號(hào))有2個(gè)或3個(gè)洗脫峰,即為FLT3-ITD突變型的樣本,見圖1,總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對(duì)應(yīng)的公式計(jì)算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本3次實(shí)驗(yàn)所得突變比例間無顯著差異,取平均值。得出13例陽性樣本突變等位基因的比例不一,分布范圍中位數(shù)34.0%(12.4%-87.0%),見表1。正常對(duì)照的10例健康人群PCR產(chǎn)物的DHPLC洗脫峰也全為單1峰。

    2 AML患者CE分析結(jié)果

    正常對(duì)照健康成人DNA標(biāo)本進(jìn)行CE的片段分析結(jié)果在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰。121例AML標(biāo)本中108例在367 bp處出現(xiàn)單個(gè)尖峰,為FLT3-ITD野生型;13例除367 bp處峰之外在367 bp后出現(xiàn)額外峰,為FLT3-ITD突變型(見121例樣本中4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、28號(hào)、79號(hào)、85號(hào),93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和 118號(hào)),見圖 2,總陽性率為13/121(10.7%)。根據(jù)以上所述對(duì)應(yīng)的公式計(jì)算出陽性樣本的突變比例。每例陽性樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)所得突變比例間無顯著差異,取平均值。13例陽性樣本間比較突變等位基因的比例不一,分布范圍中位數(shù)為34.5%(11.4%-80.2%),見表1。

    Figure1.The DHPLC characteristic elution peaks.From top to bottom:represent sample of wildtype FLT3-ITD;the 28th sample:FLT3-ITD mutation in the low percentage(12.4%);the 8th sample:FLT3-ITD mutation in the moderate percentage(42.3%);the 7th sample:FLT3-ITD mutation in the high proportion(87.0%).圖1 DHPLC的特征性洗脫峰

    表1 DHPLC和CE定量分析FLT3-ITD突變陽性樣本的結(jié)果對(duì)比Table1.The quantitative analysis of FLT3-ITD mutation in positive samples examined with DHPLC and CE methods(%.the average for three repeative experiments)

    3 2種方法結(jié)果對(duì)比

    2種方法陽性定性結(jié)果吻合,陽性率是一樣的。2種方法陽性定量結(jié)果之間比較也無顯著差異(P>0.05)。

    參照文獻(xiàn)[1],我們將突變比例分成3組。低突變 (<25%)有5例,中突變(≥25%且≤50%)有5例,高突變 (>50%)有3例。

    4 測(cè)序驗(yàn)證

    將所得樣品進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)、14號(hào),28號(hào)、79號(hào)、85號(hào),93號(hào)、107號(hào)、110號(hào)和 118號(hào)樣品為單個(gè)串聯(lián)重復(fù)突變,插入片段大小為21-87 bp不等,均為單個(gè)插入片段。結(jié)果與DHPLC、CE檢測(cè)到的陽性結(jié)果吻合。其余108例為FLT3-ITD陰性。

    討 論

    AML分層治療是近年來研究的熱點(diǎn),染色體核型異常的AML病例可按照WHO的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分層管理,而占原發(fā)病例40%-50%的核型正常的中間型病例具有高度異質(zhì)性,目前尚缺乏足夠分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行精細(xì)的分層管理和準(zhǔn)確的預(yù)后判斷[6]。作為最早被發(fā)現(xiàn)具有不良預(yù)后判斷價(jià)值的的分子指標(biāo)之一,F(xiàn)LT3-ITD的研究最為廣泛,早幾年國(guó)內(nèi)外針對(duì)FLT3-ITD定性研究較多。尹列芬等[7]已用DHPLC技術(shù)定性檢測(cè)了60例AML患者FLT3-ITD基因突變情況,認(rèn)為FLT3-ITD基因突變可作為預(yù)測(cè)AML預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。而目前這種預(yù)測(cè)價(jià)值探索深入化,有些研究者認(rèn)為FLT3-ITD等位基因突變水平的不同,預(yù)后也不同;比尹列芬他們單純的定性研究更具有預(yù)后判斷價(jià)值。比如有一項(xiàng)采用CE的方法[1]的研究以FLT3-ITD突變等位基因水平和FLT3-ITD存在與否作為分組指標(biāo),比較分析了2組病例RR、DFS和OS,顯示前者的預(yù)測(cè)作用明顯強(qiáng)于后者,差異極顯著:隨著FLT3-ITD突變比例的增加,患者的RR也隨之增加,DFS和OS降低,預(yù)后則變差;低突變水平(﹤25%)患者的預(yù)后較野生型患者差,中度突變水平(25%-50%)患者的預(yù)后又較低突變水平患者差,高度突變水平(﹥50%)患者的預(yù)后最差。Bullinger等[8]研究提示對(duì)FLT3-ITD突變等位基因進(jìn)行定量分析,有可能對(duì)AML進(jìn)行更精細(xì)的治療分層和更準(zhǔn)確的預(yù)后判斷。不過Thiede等[2]則認(rèn)為,F(xiàn)LT3-ITD低突變水平患者的預(yù)后與野生型患者相比并無差別,只有高水平的FLT3-ITD突變才具有預(yù)后判斷價(jià)值。

    Figure2.The analysis result of one sample using CE method.圖2 某一樣品的CE方法分析結(jié)果

    所以定量檢測(cè)FLT3-ITD對(duì)日后詳細(xì)判斷正常核型AML患者預(yù)后及指導(dǎo)治療具有更重要的意義。但是目前多用上述的CE方法進(jìn)行檢測(cè),該方法對(duì)儀器設(shè)備要求高或技術(shù)方法上繁瑣耗時(shí)長(zhǎng),不利于快速判斷,為進(jìn)一步探討FLT3-ITD突變等位基因水平的臨床價(jià)值,我們根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件,在DHPLC定性檢測(cè)基因突變功能的基礎(chǔ)上對(duì)FLT3-ITD突變等位基因進(jìn)行定量檢測(cè)。它是一項(xiàng)敏感可靠的DNA分析技術(shù)[9]。FLT3-ITD基因突變運(yùn)用該法的檢測(cè)是基于異源雙鏈的形成,根據(jù)PCR產(chǎn)物變性復(fù)性后,形成了同源雙鏈和異源雙鏈,而異源雙鏈由于堿基對(duì)不匹配,在部分變性的溫度條件下,會(huì)在不匹配的堿基對(duì)處形成部分解鏈。由于單鏈DNA帶負(fù)電荷減少,結(jié)合力弱,因此,異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來。根據(jù)其在柱子上保留時(shí)間的不同,可將同源雙鏈和異源雙鏈分離。如此就可分離檢測(cè)出由于ITD的插入而引起的FLT3基因長(zhǎng)度多態(tài)性,再通過對(duì)洗脫峰面積的計(jì)算,對(duì)FLT3-ITD突變等位基因即可進(jìn)行定量分析。

    應(yīng)用該方法,我們成功地對(duì)121例AML樣本進(jìn)行了檢測(cè)分析,對(duì)13例突變陽性的樣本進(jìn)行了定量計(jì)算。為驗(yàn)證DHPLC定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們采用CE的方法對(duì)樣本重復(fù)進(jìn)行了分析。從表1可知,2種方法定量的結(jié)果完全一致(P>0.05),表明本研究的DHPLC定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定。而本組的研究群體中,F(xiàn)LT3-ITD突變的陽性率只有10.7%(13/121),遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的AML中20%-30%的陽性檢出率,正常核型AML中30%-40%[9]。而這較低的陽性率可能與樣本數(shù)量有限、地域分布局限性有關(guān)。而且,目前有研究認(rèn)為FLT3-ITD定量結(jié)果不同,預(yù)后比較有顯著差異,當(dāng)然,這有待我們后續(xù)進(jìn)一步研究。

    與以往多數(shù)采用的CE方法檢測(cè)FLT3基因突變情況相比,DHPLC除具有同CE方法一樣快速、高重復(fù)性、自動(dòng)化、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)外,且具有高通量、快捷、成本相對(duì)低的特點(diǎn)[10]。它不需要熒光標(biāo)記的引物,也不需要任何PCR純化,簡(jiǎn)化了操作步驟。經(jīng)我們對(duì)比觀察,DHPLC方法檢測(cè)1個(gè)樣品所花時(shí)間不足CE方法的一半,而我們的研究又證實(shí)DHPLC的結(jié)果與CE的結(jié)果一致,更進(jìn)一步證實(shí)了DHPLC方法的可行性和實(shí)效性。雖然突變比例極高時(shí)該法不如CE精確,但計(jì)算軟件中的切割峰功能能使計(jì)算結(jié)果達(dá)到較高精確性,且并不影響對(duì)高突變比例樣本界限的判定。

    綜上所述,建立DHPLC技術(shù)相對(duì)定量檢測(cè)FLT3-ITD突變情況,能為急性髓細(xì)胞白血病臨床治療與預(yù)后提供了更詳盡的參考指標(biāo)。

    [1]Gale RE,Green C,Allen C,et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level,number,size,and interaction with NPM mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia[J].Blood,2008,111(5):2776-2784.

    [2]Thiede C,Steudel C,Mohr B,et al.Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia:association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis[J].Blood,2002,99(12):4326-4335.

    [3]Noguera NI,Ammatuna E,Zangrilli D,et al.Simultaneous detection of NPM1 and FLT3-ITD mutations by capillary electrophoresis in acute myeloid leukemia[J].Leukemia,2005,19(8):1479-1482.

    [4]秦效英,秦亞溱,劉艷榮,等.應(yīng)用變性高效液相色譜檢測(cè)伊馬替尼治療后慢性髓性白血病患者ABL激酶區(qū)點(diǎn)突變[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(11):991-995.

    [5]張之南,沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2007.106-116.

    [6]Schnittger S,Schoch C,Dugas M,et al.Analysis of FLT3length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia:correlation to cytogenetics,F(xiàn)AB subtype and prognosis in the AMLCG Study and usefulness as a marker for the detection of minmal residual disease [J].Blood,2002,100(1):59-66.

    [7]尹列芬,王 曄,姚 錦,等.急性髓細(xì)胞白血病FLT3-ITD基因突變的檢測(cè)及其臨床意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,30(4):453-455.

    [8]Bullinger L,D?hner K,Kranz R,et al.An FLT3 geneexpression signature predicts clinical outcome in normal karyotype AML[J].Blood,2008,111(9):4490-4495.

    [9]Jiang A,Jiang H,Brandwein J,et al.Prognostic factors in normal karyotype acute myeloid leukemia in the absence of the FLT3-ITD mutation[J].Leuk Res,2011,35(4):492-498.

    [10]李 莉,王 翀,陳瑤生.DHPLC系統(tǒng)工作原理及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2006(S1):120-124.

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