慢性乙肝患者外周血CD4 + CD25 + FOXP3 +Tregs 及HBV 抗原特異性CTLs 的檢測和分析*

莊 鵬， 王湘郴， 羅國輝， 何 英， 吳正林

(深圳市第四人民醫(yī)院感染科，廣東 深圳518033)

CD4+CD25+FOXP3+是調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Tregs)公認的鑒別標記，Treg 可通過與T細胞的相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機制［1］。HBV 感染后機體不充分的特異性細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTLs)應(yīng)答不僅不能清除病毒，反而可通過介導(dǎo)非特異性T 細胞應(yīng)答導(dǎo)致肝臟損傷［2］。為進一步探討Treg 在乙型肝炎發(fā)病中的作用，本研究采用“一步法”流式檢測Treg 細胞技術(shù)對慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg 細胞的頻率特點進行了觀察，同時使用酶聯(lián)免疫斑點方法對CHB 患者HBV 抗原特異性CTLs 的表達進行了檢測，現(xiàn)報道如下。

材 料 和 方 法

1 資料

1.1 研究對象 選擇28 例在我院感染科門診就診的HBeAg 陽性且未應(yīng)用過核苷類似物治療的CHB患者，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》標準。其中男性17 例，女性11 例。年齡16 - 58 歲，平均(35.56 ±14.78)歲。另選取健康對照組15 例，其中男性10 例，女性5 例，年齡18 -65 歲，平均(37.52 ±14.25)歲，均無肝炎病史，肝炎病原學(xué)血清標志物檢測均陰性，肝功能均正常。

1.2 入選標準 觀察組篩選前HBsAg 陽性至少6個月，篩選時血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平升高(≥2 -10 倍正常上限，upper limits of normal，ULN);定量測定血清HBV DNA 水平≥108copies/L。所有病例均排除合并腫瘤、自身免疫性疾病、酒精性肝病、藥物性肝炎、遺傳性肝病及丙型肝炎病毒(hepatits C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(hepatits D virus，HDV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)混合感染等，也未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)藥物治療。

1.3 主要試劑和儀器 One Step Staining Human Treg FlowTMKit (FOXP3 Alexa Fluor? 488/CD25 PE/CD4 PerCP，Biolegend);HBV ELISPOT Kit、EZ - Sep人淋巴細胞分離管、Lympho - SpotTM無血清培養(yǎng)基(達科為公司);Cell Staining Buffer (FBS，Biolegend);HBV DNA 試劑盒(深圳匹基生物工程有限公司)，流式細胞儀(BD)。

2 方法

2.1 外周血單個核細胞的分離采集與計數(shù) 取5 mL新鮮外周血(肝素抗凝)加入分離管，放入離心機。25 ℃、800 ×g 離心10 min。用吸管將含外周血單個核細胞液體層轉(zhuǎn)移到無菌15 mL 尖底離心管，加入10 mL Lympho - SpotTM無血清培養(yǎng)基，25 ℃、250 × g 離心10 min。棄上液，將細胞沉淀重懸于1 mL Lympho -SpotTM無血清培養(yǎng)液，計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果用Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度為2.5 ×109/L。

2.2 “一步法”流式檢測調(diào)節(jié)性T 細胞 準備破膜劑及緩沖液。在每管中加入100 μL 準備好的細胞懸液(約106細胞)，每管加入1 mL 1 × BioLegend's FOXP3 Fix/Perm 液，漩渦混勻后室溫孵育20 min。離心后棄去上清。加入2 mL cell staining buffer，250×g 離心5 min 后棄去上清。用1 mL FOXP3 Perm buffer(1 ×)洗滌細胞1 次。用1 mL FOXP3 Perm buffer(1 ×)重懸細胞，室溫孵育15 min，離心后棄去上清，加入20 μL 抗體cocktail，對照管加入20 μL 同型對照cocktail;輕輕漩渦重懸細胞。室溫避光孵育30 min。用staining buffer 洗滌細胞2 次，最后用0.5 mL staining buffer 重懸上機檢測。

2.3 酶聯(lián)免疫斑點法檢測乙肝病毒特異性T 淋巴細胞 按試劑盒操作說明，實驗孔4 孔，每孔加入200 μL Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基，室溫靜置5 -10 min，傾倒。每孔加入細胞100 μL，陰性對照孔加入10 μL Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基，陽性對照孔加入10 μL PHA。HBV 抗原刺激孔每孔加入10 μL HBV 特異性抗原，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 -20 h。洗板，每孔加入100 μL 稀釋好的生物素標記的抗體，37 ℃、孵育1 h。洗板后每孔加入100 μL 的顯色液，室溫避光靜置25 min。待斑點生長到適合的大小之后，終止顯色過程，ELISPOT 板斑點計數(shù)，并記錄斑點的各種參數(shù)，做統(tǒng)計分析。

2.4 其它觀察指標 實時熒光PCR 方法擴增CHB患者HBV DNA，同時檢測HBV 血清學(xué)指標以及ALT，HBV DNA 檢測下限為≤5 ×105copies/L。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

臨床數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理，計量資料采用t 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)檢驗。

結(jié) 果

1 CHB 患者和健康對照者臨床指標及CD4+CD25+FOXP3+ Treg 細胞的表達水平檢測

與健康對照組相比，CHB 患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg 表達明顯增加，差異顯著(P ＜0.05)，見表1。流式細胞儀檢測情況見圖1A、B。

表1 CHB 患者和健康對照者臨床指標和CD4 + CD25 +FOXP3 +Treg 細胞的表達檢測Table 1. The detection of clinical index and CD4 + CD25 +FOXP3 +Tregs in two groups(±s)

* P ＜0.05 vs control group.

Group n HBV DNA 106copies/L ALT(U/L)CD4 +CD25 +FOXP3 +Tregs(%.97 Health control 15 0 22.7± 8.5 1.95±0.68 CHB patient 28 6.892±0.974 195.8±84.6 3.14±0*)

2 CHB 患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的表達水平與病毒載量的相關(guān)性分析

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CHB 患者外周血中Treg 頻率與血清HBV DNA 取對數(shù)后呈正相關(guān)(r = 0.831，P ＜0.01)，見圖3A。而與ALT 水平無明顯相關(guān)性(P ＞0.05)。

Figure 1. Treg frequencies in one health control (A)and one CHB patient(B).圖1 健康對照A 和CHB 患者組外周血中Treg 頻率示例

Figure 2. The results of ELISPOT assay for CTL counting in one CHB patient(A)and one healthy control(B).圖2 CHB 患者和健康對照CTL 斑點計數(shù)檢測孔示例

3 HBV 特異的細胞毒性T 淋巴細胞斑點計數(shù)觀察及與Treg 頻率的相關(guān)性分析

通過對斑點進行計數(shù)，健康對照組檢測呈陰性，CHB 組CTL 斑點數(shù)目為陽性(19.28 ±3.85)，見圖2A、B;CTL 數(shù)目與Treg 頻率的相關(guān)性分析，顯示兩者呈負相關(guān)(r= -0.540，P ＜0.01)，見圖3B。

Figure 3. Correlation analysis between Treg frequency and HBV DNA levels in CHB patients(A)and between Treg frequency and HBV-specific CTL number in CHB patients(B).圖3 CHB 患者外周血中Treg 頻率與血清HBV DNA 對數(shù)值、Treg 頻率與HBV 特異的CTL 數(shù)目的相關(guān)性分析

討 論

在HBV 感染的免疫調(diào)節(jié)中，Treg 可通過與T 細胞的相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機制，可使HBV 和機體的效應(yīng)細胞之間維持一種穩(wěn)態(tài)，在防止過強的免疫損傷和清除病原體之間取得平衡［3，4］。但是當前對于Treg 細胞表達及在慢性HBV 感染患者免疫發(fā)病機制中的作用尚存爭議［4，5］。因此，檢測CHB 患者外周血中Treg 的頻率和特異性CTL 表達對于闡明乙型肝炎慢性化的機制和探討有效的免疫治療策略均有重要的臨床意義。

FOXP3 作為一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子特異性地高表達在Tregs 上，在一定程度上可反映Treg 的水平和功能活性，可作為證實Treg 的金標準［4］。本研究通過“一步法”同時進行細胞表面、胞內(nèi)FOXP3 標記，可有效簡化實驗步驟，節(jié)約操作時間，有利于減少檢測結(jié)果的不穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+Treg 細胞在慢性乙型肝炎感染者中明顯增高，與HBV DNA 載量呈正相關(guān)，與多數(shù)文獻報道相一致［6-8］，說明慢性HBV 感染者體內(nèi)的Treg 頻率增高可能是導(dǎo)致機體清除HBV 能力下降的重要原因，提示機體可能通過Treg 的免疫抑制效應(yīng)促進了病毒的復(fù)制，導(dǎo)致免疫耐受發(fā)生，促進了疾病的慢性化。

由于CHB 患者外周血中特異性CTL 水平極低，傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法難以準確計數(shù)，本研究采用乙肝病毒特異性T 淋巴細胞酶聯(lián)免疫斑點診斷試劑盒檢測人外周血樣本中HBV 抗原特異的T 淋巴細胞在HBV 特異性抗原刺激后IFN-γ 分泌情況，從而對可分泌乙肝特異性IFN -γ 的活化CTL 進行了精確定量。我們觀察到Treg 數(shù)量與HBV 特異性CTL 表達呈負相關(guān)，推測相對較低的Treg 數(shù)量有利于HBV 特異性CTL 的細胞。免疫反應(yīng)發(fā)揮清除病毒的作用，提示Treg 可能通過下調(diào)HBV 特異性CTL 的免疫學(xué)效應(yīng)而造成病毒不能被清除，進而造成乙肝病毒在患者體內(nèi)慢性持續(xù)存在，這可能也是造成機體對乙肝病毒免疫耐受主要因素之一。

本研究證實了Treg 細胞與HBV 特異性CTL 的表達呈負相關(guān)，提示監(jiān)測外周血Treg 細胞比例有望成為評價患者體內(nèi)細胞免疫狀態(tài)的有效指標，從而為探討通過控制Treg 的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)作為治療的新策略提供了新思路，但對于Treg 細胞在HBV 感染免疫耐受狀態(tài)中的具體作用和調(diào)節(jié)機制仍需深入研究。

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