脾虛證進(jìn)程中小鼠特異性/非特異性免疫功能變化及中藥的干預(yù)作用

段永強(qiáng) 成映霞 程 容 梁玉杰 朱立鳴 (甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅 蘭州 730020)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證明衰老進(jìn)程中主要伴隨著機(jī)體免疫功能的紊亂或低下，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官功能障礙和代謝廢物的堆積。而且中醫(yī)學(xué)所論之“脾”包涵著豐富的免疫學(xué)內(nèi)容，脾虛證與機(jī)體免疫器官、非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫以及免疫遺傳學(xué)等方面異常改變均有顯著相關(guān)性〔1〕。脾腎兩虛是中醫(yī)學(xué)關(guān)于衰老的主要病機(jī)之一，健脾補(bǔ)腎已成為歷代醫(yī)家延緩衰老和治療虛勞病癥的重要法則。敦煌大寶膠囊(DHDB)是從敦煌石窟遺書中選方化裁，由熟地、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、大黃等藥味提取加工組成，具有健脾益氣、強(qiáng)腎填精、滌痰祛瘀、安和五臟的功效。該制劑經(jīng)臨床應(yīng)用顯示能夠有效防治各種虛勞病癥，前期研究表明〔2，3〕DHDB具有提高衰老大鼠腦組織細(xì)胞膜鈉泵活性，拮抗自由基損傷而保護(hù)細(xì)胞的功能，為進(jìn)一步探討該藥對脾虛證的干預(yù)效應(yīng)，本研究觀察了脾虛證進(jìn)程中小鼠部分特異性/非特異性免疫功能的變化及DHDB囊的作用效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 采用SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，鼠齡5 w，體重(20±1)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級動物合格證號:SCXK(甘)2004-0006-0000201;SPF級實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證:SYXK(甘)2004-0006-000092。受試動物按體重編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法〔4〕分為空白對照組、模型組、DHDB大劑量組、DHDB中劑量組、DHDB小劑量組、補(bǔ)中益氣丸組(表示為“陽性對照組Ⅱ”)，每組8只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品試劑與儀器 DHDB(院內(nèi)制劑，批號040925);補(bǔ)中益氣丸(陽性對照組Ⅱ，蘭州佛慈制藥廠生產(chǎn)，批號20040912);RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司，批號:20050109);聚羥基脂肪酸酯(PHA)(Sigma公司，批號:20050106);刀豆球蛋白 A(Cloncanavalin，ConA，Sigma公司，批號:20050109);脂多糖(Lipopoly Saccharide，LPS，Sigma 公司，批號:20050109);MTT(瑞士Fluka公司，批號:20050224);新生牛血清(上海華美生物工程公司，批號:20050210);淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司，批號:20050208);CO2恒溫培養(yǎng)箱(規(guī)格型號:MCO-15AC，日本SANYO);酶聯(lián)免疫檢測儀(規(guī)格型號:BENCHMARK PULS，美國BIO-RAD);電熱恒溫培養(yǎng)箱(規(guī)格型號:L-303)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及給藥 脾虛模型的建立〔5〕:空白對照組每日灌胃等量蒸餾水外，其余小鼠以0.2 ml/10 g生大黃液(每ml含生藥1 g)灌胃，每日2次，連續(xù)8 d?？瞻讓φ战M、脾虛模型組給予同體積蒸餾水灌胃;DHDB大、中、小劑量組分別予0.8，0.4和0.16 g·kg－1·d－1DHDB藥劑灌胃，等效劑量按人與動物體型系數(shù)折算〔6〕(相當(dāng)于成人劑量的10倍、5倍和2倍);給予陽性對照組Ⅱ0.4 g·kg－1·d－1補(bǔ)中益氣丸藥劑灌胃(相當(dāng)于成人劑量的5倍)。各組均以蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。連續(xù)灌胃14 d，給藥容積為0.15 ml/10 g體重。

1.2.2 指標(biāo)檢測及方法

1.2.2.1 DHDB對脾虛證小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液1 ml，30 min后頸椎脫臼處死，正中剪開腹壁皮膚，取1 ml生理鹽水灌洗腹腔，吸出灌洗液0.5 ml，平均分滴于2張載玻片上，用生理鹽水漂洗，以除去未貼壁細(xì)胞，自然干燥，甲醇溶液固定，加入瑞氏染液染色1 min，滴加pH 6.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)與染液混勻，靜置5 min，自來水沖去染料，干燥后鏡下觀察計(jì)數(shù)。計(jì)算吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞×100%;吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞×100%。

1.2.2.2 DHDB對ConA，LPS誘導(dǎo)脾虛小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥1 h后，頸椎脫臼處死動物，無菌取脾組織，用Hank's液制成6×107/ml脾細(xì)胞懸液。于4×10孔滅菌培養(yǎng)板上分別加入ConA或LPS 100 μl，再按實(shí)驗(yàn)動物組別，加入相應(yīng)脾細(xì)胞100 μl，ConA終孔濃度為7.5 μg/ml。LPS終孔濃度為7.8 μg/ml。將培養(yǎng)板置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃飽和濕度下，培養(yǎng)48 h。各孔加入MTT 10 μl后，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去各孔上清液，加入100 μl DMSD，于酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在570 nm處測光密度值，作為反映淋巴細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。

1.2.2.3 DHDB對脾虛證小鼠NK細(xì)胞活性的影響 動物分組給藥及模型的建立同“1.2.1”。于末次給藥后1 h，脫臼處死小鼠，無菌條件取脾，用眼科剪刀剪碎，75 μm篩網(wǎng)過濾，制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，低滲除去紅細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去上清，用生理鹽水制成單細(xì)胞懸液，并稀釋至3.0×103個(gè)/L。靶細(xì)胞取K562體外培養(yǎng)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×102個(gè)/L，使效靶細(xì)胞比為20∶1。取96孔培養(yǎng)板分別加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照，于37℃ 體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件培養(yǎng)12 h后，加入MTT染色液，再培養(yǎng)4 h后，甩板，加入DMSO搖勻，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm測吸光度值。NK細(xì)胞活性(%)=〔TO－(S－E)〕/TO×100%，式中TO為靶細(xì)胞對照孔吸光度值，S為實(shí)驗(yàn)孔吸光度值，E為效應(yīng)細(xì)胞孔吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DHDB對脾虛證小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)降低(P＜0.05);與模型組比較，DHDB各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)升高(P＜0.05)。見表1。

表1 DHDB對脾虛小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率/吞噬指數(shù)，ConA，LPS誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和NK細(xì)胞活性的影響(n=8，)

表1 DHDB對脾虛小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率/吞噬指數(shù)，ConA，LPS誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和NK細(xì)胞活性的影響(n=8，)

與空白對照組相比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 吞噬百分率(%) 吞噬指數(shù) OD值(570 nm)ConA LPS NK細(xì)胞活性(%)空白對照組 同體積溶媒 44.70±4.97 0.82±0.14 0.80±0.15 0.69±0.10 24 22.41±3.81.53±4.91模型組 同體積溶媒 39.00±4.491) 0.69±0.111) 0.57±0.211) 0.49±0.092) 19.45±4.641)DHDB大劑量組 0.80 42.51±5.79 0.73±0.09 0.79±0.143) 0.63±0.123) 21.18±5.00 DHDB中劑量組 0.40 44.27±6.073) 0.78±0.123) 0.72±0.20 0.51±0.15 23.79±3.853)DHDB小劑量組 0.16 39.67±4.96 0.71±0.07 0.63±0.19 0.46±0.16 22.63±3.01陽性對照組Ⅱ 0.40 43.18±5.653) 0.81±0.083) 0.78±0.183) 0.66±0.134)

2.2 DHDB對ConA，LPS誘導(dǎo)脾虛小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)水平降低，對比組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，DHDB各組小鼠ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)水平升高，對比組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 DHDB對脾虛證小鼠NK細(xì)胞活性的影響與空白對照組比較，模型組小鼠NK細(xì)胞活性降低，對比組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，DHDB各組小鼠NK細(xì)胞活性升高，對比組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

3 討論

研究表明中醫(yī)學(xué)的“脾”包涵著豐富的免疫學(xué)內(nèi)容，而脾虛證與免疫器官、非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫以及免疫遺傳學(xué)等方面異常改變均有顯著相關(guān)性〔1〕。脾臟是外周免疫器官，脾臟內(nèi)含大量由骨髓干細(xì)胞發(fā)育而來的B細(xì)胞和大量T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，是各種免疫細(xì)胞居住、增殖并進(jìn)行免疫應(yīng)答及產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)，合成巨噬細(xì)胞增強(qiáng)激素的主要場所?！捌⑻撟C”一般有腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及分泌白細(xì)胞介素-1(IL-1)等的能力下降。巨噬細(xì)胞不僅通過吞噬、殺傷和消化病原微生物等抗原物質(zhì)發(fā)揮非特異性免疫功能，而且通過分泌多種細(xì)胞因子，提示抗原啟動特異性免疫應(yīng)答及抗腫瘤等作用參與特異性免疫應(yīng)答的各階段。脾虛時(shí)單核吞噬細(xì)胞功能下降，說明脾虛證機(jī)體非特異性免疫功能失調(diào)，腹腔巨噬細(xì)胞功能下降是脾虛證免疫機(jī)能失調(diào)的重要機(jī)制之一〔7，8〕。

淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程的一個(gè)重要階段。因此檢測淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常用方法。T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。ConA和LPS是T、B淋巴細(xì)胞特異性較強(qiáng)的活化刺激劑，在ConA和LPS活化條件下，起反應(yīng)的主要是T細(xì)胞和B細(xì)胞。

NK細(xì)胞活性代表機(jī)體的天然防御功能，其對靶細(xì)胞的作用范圍遠(yuǎn)大于殺傷性T細(xì)胞，能殺傷某些病毒感染細(xì)胞，而對正常未感染細(xì)胞無殺傷作用。同時(shí)是機(jī)體維持免疫監(jiān)視功能的主要細(xì)胞，通過釋放淋巴因子如干擾素(IFN-α)、IFN-γ、IL-2等對T、B細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，有助于機(jī)體自身穩(wěn)定。研究表明脾虛小鼠NK細(xì)胞功能明顯降低，自身穩(wěn)定遭受嚴(yán)重破壞〔9〕。

DHDB以熟地黃和黃芪兩味為君而健脾益精、補(bǔ)益氣血;輔用當(dāng)歸補(bǔ)血活血為臣而養(yǎng)心脾益肝腎;茯苓補(bǔ)脾益胃，淡滲利水去濕而祛痰，補(bǔ)中有動，以防補(bǔ)氣藥過于壅滯為之佐藥。全方共奏后天脾胃培補(bǔ)先天之腎，先天之腎資助后天脾胃，氣血同源互生互化，力求固元培本而健脾益氣。本方特色是應(yīng)用小劑量大黃以通為補(bǔ)，通利腸胃?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明熟地黃、黃芪、當(dāng)歸、大黃均對機(jī)體免疫功能具有正向調(diào)節(jié)作用〔10～13〕。本研究表明DHDB可顯著提高脾虛證小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，顯著提高脾虛證小鼠NK細(xì)胞活性(P﹤0.05);在DHDB作用下，脾細(xì)胞對ConA和LPS刺激的增殖反應(yīng)均有增強(qiáng)(P﹤0.05)，提示DHDB既能增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)，又能增強(qiáng)B細(xì)胞反應(yīng)，具有提高機(jī)體免疫功能的作用。

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