晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮 -間葉轉(zhuǎn)化

邵維斌,彭淑娟,夏春英,李 忻,荀 康

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江,212002)

腹膜纖維化和大量新生血管形成是導(dǎo)致長期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1-2]。隨著腹膜透析的進行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)、葡萄糖降解產(chǎn)物等可引起腹膜間皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞表型,如 E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白等表達下降,同時獲得肌纖維母細(xì)胞樣的特性,如 snail蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達上升,即發(fā)生上皮 -間葉轉(zhuǎn)化[3-4],這種發(fā)生 EMT的腹膜間皮細(xì)胞具有浸潤和遷移的能力,因而腹膜間皮細(xì)胞 EMT可能是導(dǎo)致腹膜纖維化和新生血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5],本研究建立了大鼠腹膜間皮細(xì)胞 EMT模型來探討腹膜間皮細(xì)胞 EMT在腹膜透析時腹膜損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠腹膜間皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定[6],取第 3代細(xì)胞進行實驗。

1.2 分組

①對照組:正常的 M199培養(yǎng)基;② 40 mmol/L AGEs組:含 40 mmol/L AGEs-BSA(AGEs牛血清白蛋白,美國 Biovision公司)的M199培養(yǎng)基;③ 80 mmol/L AGEs組:含 80 mmol/L AGEs-BSA的 M199培養(yǎng)基;④牛血清白蛋白(BSA)組:含 80 mmol/L BSA的 M199培養(yǎng)基。第 3代大鼠腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)上述各組培養(yǎng)基培養(yǎng) 48、72 h后收集細(xì)胞,分別提取 RNA、蛋白。

1.3 實時定量 PCR檢測 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表達

細(xì)胞總 RNA抽提按 Trizol試劑盒的方法進行,運用實時定量 PCR試劑盒(德國 Qiagen公司)檢測,反轉(zhuǎn)錄 50℃、20 min,E-cadherin引物序 列 :正 義鏈 5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′,反義鏈 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTC T-3′。 α-SMA引物序列:正義鏈 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′,反義鏈 5′-ACGA AGGAATAGCCACGCTCA-3′。 CollagenI引物序列 :正義鏈 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCG G-3′,反義鏈 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正義鏈 5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′, 反義鏈 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。 VEGF引物序列:正義鏈 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反義鏈 5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH引物序列:正義鏈 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反義鏈 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活 95℃、15 min,E-cadherin反應(yīng)條件:94℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 45 s,35個連續(xù)循環(huán);α-SMA反應(yīng)條件:94℃變性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,28個連續(xù)循環(huán);CollagenI反應(yīng)條件:94℃變性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,29個連續(xù)循環(huán)。TGF-β1反應(yīng)條件:94℃變性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,35個連續(xù)循環(huán)。VEGF反應(yīng)條件:94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,40個連續(xù)循環(huán)。得出 Ct值按公式 2-Ct求出基因表達的相對變化量[7],然后進行各組間比較。

1.4 Western blot法檢測 E-cadherin、α-SMA蛋白的表達

裂解處理后的大鼠腹膜間皮細(xì)胞,4℃ 1 000 r/min離心 10 min后取裂解液上清測蛋白濃度,取細(xì)胞裂解蛋白(約 30μg)經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉 2 h,分別加入小鼠抗 E-cadherin抗體(美國 BD公司)、小鼠抗 α-SMA抗體(丹麥 Dako公司)和小鼠抗 β-actin抗體(美國 CST公司)4℃過夜,洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠 IgG抗體(美國 CST公司),37℃、1.5 h,洗膜后加 ECL試劑,X線自顯影顯示結(jié)果,分析光帶的吸光度。

1.5 ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中 TGF-β1和VEGF

大鼠腹膜間皮細(xì)胞分組干預(yù)48 h和72 h后,離心收集細(xì)胞上清液,按 ELISA試劑盒說明檢測TGF-β1和 VEGF蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞鑒定

腹膜間皮細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多邊形等,融合后呈典型的鋪路石樣。免疫組化結(jié)果示細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)、波形蛋白(vimentin)陽性。

2.2 AGEs刺激大鼠腹膜間皮細(xì)胞引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常大鼠腹膜間皮細(xì)胞呈鋪路石狀,在AGEs作用 48 h后大鼠腹膜間皮細(xì)胞失去原來的整齊排列,細(xì)胞逐漸拉長,作用 72 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梭形或不規(guī)則形改變,似成纖維細(xì)胞,部分細(xì)胞出現(xiàn)互相交叉重疊現(xiàn)象。

2.3 AGEs對大鼠腹膜間皮細(xì)胞 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達的影響

實時定量 PCR檢測結(jié)果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后, α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 1-4),而 E-cadherin mRNA表達水平隨時間延長逐漸下降(圖 5)。與對照組及 BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組間皮細(xì)胞 α-SMA mRNA的相對表達量

圖2 各組間皮細(xì)胞 Collagen I m RNA的相對表達量

圖3 各組間皮細(xì)胞 TGF-β1 mRNA的相對表達量

圖4 各組間皮細(xì)胞 VEGF m RNA的相對表達量

圖5 各組間皮細(xì)胞 E-cadherin m RNA的相對表達量

2.4 AGEs對大鼠腹膜間皮細(xì)胞 E-cadherin、α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,α-SMA蛋白表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 6),而 E-cadherin蛋白表達水平隨時間延長逐漸下降(圖 7)。與對照組及BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

ELISA結(jié)果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,TGF-β、VEGF蛋白表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 8-9),與對照組及BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 各組間皮細(xì)胞 α-SMA蛋白的相對表達量

圖7 各組間皮細(xì)胞 E-cadherin蛋白的相對表達量

圖8 各組間皮細(xì)胞 TGF-β1蛋白的表達水平

圖9 各組間皮細(xì)胞 VEGF蛋白的表達水平

3 討 論

腹膜透析(peritoneal dialysis)已進入臨床 30余年,隨著其裝置的不斷改進,在我國越來越多慢性腎衰患者開始腎替代治療時首選腹膜透析療法。然而隨著腹膜透析時間延長,由于反復(fù)發(fā)作的腹膜炎、機體的炎癥狀態(tài)以及非生理性透析液尤其是高濃度葡萄糖、葡萄糖降解產(chǎn)物、AGEs等可引起腹膜結(jié)構(gòu)改變和腹膜功能衰竭,臨床上出現(xiàn)超濾失敗[8]。這是患者退出腹膜透析的主要原因之一,同時也制約了腹膜透析的應(yīng)用和發(fā)展[9]。長期腹膜透析患者腹膜出現(xiàn)表層間皮細(xì)胞消失、大量新生血管形成及透明樣血管病變、纖維化等病理改變,腹膜纖維化和大量新生血管形成是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的主要原因。但目前對于導(dǎo)致腹膜纖維化和新生血管形成的機制尚不完全清楚。因此探討腹膜纖維化和新生血管形成的機制,并尋求有效的防治方法,具有重要的臨床意義。正常人的腹膜或非腹膜透析腎衰竭患者的腹膜中并不存在肌成纖維細(xì)胞[10]。近年來,越來越多的證據(jù)表明[2,10],腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細(xì)胞明顯增多,肌成纖維細(xì)胞的特性是具有合成細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子及參與炎癥反應(yīng)的能力,并具有收縮功能,還可表達平滑肌肌動蛋白,兼有纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞兩者的特性,在各種修復(fù)及纖維化過程中,肌成纖維細(xì)胞起重要作用。過去認(rèn)為其主要來源于腹膜組織中活化的成纖維細(xì)胞;然而最近的研究發(fā)現(xiàn)[2-4,11-12]:隨著腹膜透析的進行,腹膜透析患者腹膜間皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞表型,同時獲得肌纖維母細(xì)胞樣的特性,即發(fā)生 EMT。研究證明 EMT在腎、肝、肺等器官纖維化中有重要的作用[13-15]。因而有學(xué)者推測發(fā)生 EMT的腹膜間皮細(xì)胞可能是腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細(xì)胞的主要來源之一[4]。但腹膜間皮細(xì)胞 EMT在腹膜纖維化和新生血管形成中的作用及機制目前尚不完全清楚。

作者先前的研究表明:高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞 EMT[16],在本研究中我們探討了 AGEs對大鼠腹膜間皮細(xì)胞 EMT的影響。我們體外研究發(fā)現(xiàn):AGEs不僅能引起大鼠腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)改變(由典型的上皮細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形,類似肌成纖維細(xì)胞),而且晚期糖基化終產(chǎn)物還能上調(diào)大鼠腹膜間皮細(xì)胞 α-SMA、Collagen I mRNA和 α-SMA蛋白表達水平和下調(diào)大鼠腹膜間皮細(xì)胞 E-cadherin mRNA和蛋白表達水平,表明 AGEs誘導(dǎo)了大鼠腹膜間皮細(xì)胞 EMT;同時我們發(fā)現(xiàn) AGEs能上調(diào)大鼠腹膜間皮細(xì)胞 TGF-β、VEGF mRNA和蛋白表達水平,而 TGF-β、VEGF在腹膜透析時腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用。我們研究結(jié)果為進一步探討腹膜間皮細(xì)胞 EMT在腹膜纖維化和新生血管形成中的作用及機制提供了體外模型及實驗基礎(chǔ)。

[1] Mateijsen MA,van der Wal AC,Hendriks PM,et al.Vascular and interstitial changes in the peritoneum of CAPD patients with peritoneal sclerosis[J].Perit Dial Int,1999,19(6):517.

[2] Devuyst O,Margetts PJ,Topley N.The pathophysiology of the peritoneal membrane[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(7):1077.

[3] Vargha R,Endemann M,Kratochwill K.Ex vivo reversal of in vivotransdifferentiation in mesothelial cells grown from peritoneal dialysate effluents[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(10):2943.

[4] Aroeira L S,Aguilera A,Sánchez-Tomero J A,et al.Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients:pathologic significance and potential terapeutic interventions[J].JAm Soc Nephrol,2007,18(7):2004.

[5] Yanez-Mo M,Lara-Pezzi E,Selgas R,et al.Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells[J].N Engl J Med,2003,348(5):403.

[6] 邵維斌,錢家麒.從網(wǎng)膜組織法培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10(1):92.

[7] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method[J].Methods,2001,25(4):402.

[8] Brimble K S,Walker M,Margetts P J,et al.Meta-Analysis:peritoneal membrane transport,mortality,and technique failure in peritoneal dialysis[J].J Am Soc Nephrol,2006,17(9):2591.

[9] Gokal R.Peritoneal dialysis in the 21st century:an analysis of current problems and future developments[J].J Am Soc Nephrol,2002,13(Suppl 1):S104.

[10] Jimenez-Heffernan JA,Aguilera A,Aroeira L S,et al.Immunohistochemical characterization of fibroblast subpopulations in normal peritoneal tissue and in peritoneal dialysisinduced fibrosis[J].Virchows Arch,2004,444(3):247.

[11] Aroeira L S,Aguilera A,Selgas R,et al.Mesenchymal conversion of mesothelial cells as a mechanism responsible for high solute transport rate in peritoneal dialysis:Roleof vascular endothelial growth factor[J].Am J Kidney Dis,2005,46(5):938.

[12] Kim Y L.Update on mechanisms of ultrafiltration failure[J].Perit Dial Int,2009,29(Suppl 2):S123.

[13] Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(2):212.

[14] Rippe B.Peritoneal angiogenesis in response to dialysis fluid[J].Hepatology,2009,50(6):2007.

[15] Corvol H,Flamein F,Epaud R,et al.Lung alveolar epithelium and interstitial lung disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(8-9):1643.

[16] 邵維斌,荀 康,李 忻,等.高濃度葡萄糖誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮 -間葉轉(zhuǎn)化[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(17):4.