彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者血漿MGMT基因甲基化與化療療效關(guān)系

康馬飛 駱梅青 劉 瑛 廖漓漓 陳 瑩

一部分彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療方案(CHOP)抗拒或繼發(fā)性耐藥，其原因不明。O6甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一種非常重要的DNA修復(fù)酶。烷化劑的細(xì)胞毒作用主要是由于DNA內(nèi)O6位鳥(niǎo)嘌呤烷基化所引起，MGMT將烷基從O6鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移到半胱氨酸殘基內(nèi)，修補(bǔ)DNA的完整性。腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑耐藥常與高水平的DNA修復(fù)蛋白MG-MT有關(guān)。研究表明，甲基化是MGMT基因失活的主要機(jī)制之一，MGMT基因甲基化可使MGMT表達(dá)和活性明顯下降，因此，MGMT甲基化從另一方面反映了MGMT的表達(dá)和活性。本研究通過(guò)觀(guān)察30例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者血漿甲基化MGMT基因在化療前后的表達(dá)情況，了解血漿甲基化MGMT基因表達(dá)與化療療效之間的關(guān)系，為血漿甲基化MGMT基因表達(dá)能否作為DLBCL化療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2008年10月至2010年4月期間桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治且經(jīng)病理確診的30例DLBCL患者，男性18例，女性12例，年齡34～76歲，中位年齡為54歲。測(cè)定所有患者化療前的血漿甲基化MGMT基因表達(dá)情況。所有患者均給予CHOP方案(環(huán)磷酰胺750mg/m2，第1天;阿霉素50 mg/m2，第1天;長(zhǎng)春新堿1.4 mg/m2，第1天;強(qiáng)的松60 mg/m2，第1～5天;每21d重復(fù))治療，每2個(gè)周期評(píng)價(jià)療效1次，并測(cè)定所有患者的血漿甲基化MGMT基因表達(dá)，共6個(gè)周期。

1.2 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

按“Cheson淋巴瘤療效標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為 CR、CRu、PR、SD 和復(fù)發(fā)/PD，總有效率(ORR)=CR+CRu+PR。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集

分別于患者化療前、第3個(gè)化療周期前、第5個(gè)化療周期前收集其周?chē)o脈血液標(biāo)本2ml于EDTA抗凝管中，以3 000r/min離心15min分離獲得血漿，將血漿置于-20℃保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定甲基化MGMT基因檢測(cè)。

1.3.2 DNA的提取

血漿DNA的提取采用CWBIO康為世紀(jì)公司的TissueGen DNA Kit(ca.t no.CW0546)試劑盒，操作步驟如下:①取 100μl樣品加入 Buffer GTL補(bǔ)足至200μl;②加入200μl proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻;③加200μl Buffer GL，渦旋震蕩充分混勻，加入200μl無(wú)水乙醇，渦旋震蕩充分混勻;④將步驟3所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，10 000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中;⑤向吸附柱中加入500μl Buffer GW1，10 000 r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中;⑥向吸附柱中加入500μl Buffer GW2，10 000r/min 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重復(fù)該步驟一次;⑦12 000r/min離心2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干;⑧將吸附柱置于一個(gè)新的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入50～200μl Buffer GE，室溫放置5min，10 000r/min離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

1.3.3 DNA的修飾

血漿中腫瘤細(xì)胞釋放的DNA經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉修飾，CpG中未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生變化。修飾過(guò)程:①取20μl DNA，加入裝有 130μl CT Conversion Reagent solution的PCR 管中，98℃水浴8min，64℃金屬浴3.5h，4℃冰箱保存20h。②往已裝入收集管的吸附柱中加入600μl M-Binding Buffer。③把步驟①所得的150μl液體全部加入到收集管中，10 000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。④向吸附柱中加入100μl M-wash Buffer，10 000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑤向吸附柱中加入200μl M-Desulphonation Buffer，置室溫(20 ～30℃)20min，10 000r/min 離心 30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑥向吸附柱中加入200μl M-wash Buffer，10 000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。再重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1次。⑦把吸附柱放入1.5ml的EP管中，向吸附柱中加入10μl M-Elution Buffer，10 000r/min離心 30s，收集 DNA 溶液，-20℃保存DNA。

1.3.4 引物序列及巢式PCR檢測(cè)

巢式PCR按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［1］，所用的引物序列及產(chǎn)物片斷大小為MGMT-F(160bp)上游引物:5'-GYGTTTYGGATATGTTGGGATAGTT-3'，下游引物:5'-AAACTCCRCACTCTTCCRAAAAC-3';MGMT-M(81bp)上游引物:5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'，下游引物:5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3';MGMT-U(93bp)上游引物:5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'，下游引物:5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'。MGMT-M用于擴(kuò)增MGMT基因5'CpG島甲基化等位基因，MGMT-U用于擴(kuò)增MGMT基因5'CpG島非甲基化等位基因。PCR分兩步進(jìn)行:首先用MGMT-F擴(kuò)增富含CpG的啟動(dòng)子區(qū)片段，反應(yīng)條件為:5×GoldStar Taq MasterMix 12.5μl，上下游 Primer各1μl，DNA 10μl，加 RNase Free dH2O至 25μl。95℃ 預(yù)變性 10min，進(jìn)入循環(huán):95℃ 變性30s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)后 72℃ 延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物稀釋30倍，取2μl進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:5×GoldStar Taq MasterMix 12.5μl，上下游 Primer各 1μl，DNA 2μl，加 RNase Free dH2O至25μl。95℃預(yù)變性10min，進(jìn)入循環(huán):95℃變性30s，56℃ 退火 30s ，72℃ 延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)試劑盒25μl(CWBIO康為世紀(jì)公司，2×GoldStar Taq MasterMix(Ca.t no.CW0939)。對(duì)全部亞硫酸氫鈉處理后的DNA樣品同時(shí)進(jìn)行了MGMT基因的非甲基化分析，均可以觀(guān)察到非甲基化產(chǎn)物，驗(yàn)證了DNA的修飾反應(yīng)是成功的。

1.3.5 SssI酶處理

為保證檢測(cè)的可靠性，以經(jīng)SssI酶處理和未經(jīng)SssI酶處理的正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA分別作為MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的陰性和陽(yáng)性對(duì)照。SssI酶處理步驟:10 × NE Buffer2 4μl，200 × SAM 0.5μl，DNA 5μl，SssI酶(4U/μl)1.5μl，加 RNase Free dH2O至40μl。37℃水浴 4h，65℃金屬浴 15min滅活 SssI酶，按照1.3.3步驟甲基化修飾及1.3.4的步驟進(jìn)行巢氏PCR。

1.3.6 凝膠電泳分析

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，溴化乙啶染色，用凝膠電泳成像儀進(jìn)行拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的差別比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療前血漿甲基化MGMT基因表達(dá)與化療療效的關(guān)系

30例DLBCL患者血漿MGMT基因甲基化率為63.3%(19/30)，血漿MGMT基因甲基化者化療有效率為100.0%(19/19)，血漿MGMT基因非甲基化者化療有效率為72.7%(8/11)，甲基化與非甲基化患者比較，化療有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法，P=0.041。)其電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 血漿MGMT基因甲基化和非甲基化的電泳圖

2.2 化療后血漿甲基化MGMT基因表達(dá)與化療耐藥的關(guān)系

血漿MGMT基因甲基化者化療后4個(gè)周期無(wú)效者1例，化療6個(gè)周期后有1例出現(xiàn)耐藥，耐藥發(fā)生率為10.5%(2/19)。血漿MGMT基因非甲基化者化療后2個(gè)周期無(wú)效者3例，化療后4個(gè)周期無(wú)效者1例，化療后6個(gè)周期無(wú)效者2例，化療后耐藥發(fā)生率為54.5%(6/11)。兩組耐藥發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.836，P=0.028)。

3 討論

MGMT基因定位于10q26，編碼產(chǎn)物MGMT是一種非常重要的修復(fù)蛋白。在烷化劑治療過(guò)程中，腫瘤O6烷基鳥(niǎo)嘌呤修復(fù)程度依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度。未能修復(fù)的O6甲基(或氯乙基)鳥(niǎo)嘌呤損害導(dǎo)致致命的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。提高烷化劑抗癌藥臨床療效的一條途徑是降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)MGMT的活性。大量研究表明，MGMT mRNA的表達(dá)水平?jīng)Q定MGMT蛋白水平，而MGMT蛋白水平直接反映MGMT酶活性［2］。

研究表明，MGMT基因甲基化可使MGMT表達(dá)和活性明顯下降。因此，MGMT甲基化基因表達(dá)情況從另一方面反映了MGMT的表達(dá)和活性。Blough等［3］的研究結(jié)果表明，腫瘤組織中MGMT啟動(dòng)子甲基化預(yù)示將獲益于烷化劑替莫唑胺(TMZ)化療。此外，MGMT啟動(dòng)子甲基化還是一個(gè)良好的無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后指標(biāo)［4，5］。

臨床上因有的腫瘤不易取到組織，或不易在腫瘤治療過(guò)程中反復(fù)獲取組織，所以有學(xué)者開(kāi)始尋找更方便獲得標(biāo)本的方法(如血液)評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞MGMT基因甲基化情況。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿DNA與腫瘤組織存在一致的基因改變。Balana等［6］比較了多形性惡性膠質(zhì)瘤腫瘤組織的甲基化MGMT DNA與血漿甲基化MGMT DNA的關(guān)系，結(jié)果顯示，MGMT DNA甲基化情況在腫瘤和血漿中是一致的。

在DLBCL與MGMT甲基化關(guān)系的研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者 MGMT蛋白表達(dá)陰性率為30.2%，MGMT蛋白表達(dá)陰性者，MGMT啟動(dòng)子甲基化達(dá)88.2%，而MGMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性者，MGMT啟動(dòng)子甲基化僅19.0%，提示MGMT蛋白表達(dá)缺乏與啟動(dòng)子甲基化相關(guān)［7］，說(shuō)明啟動(dòng)子甲基化與MGMT蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但有研究卻發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化測(cè)定不一定能準(zhǔn)確預(yù)告基因靜默狀態(tài)［8］，MGMT表達(dá)與非甲基化狀態(tài)，MGMT不表達(dá)與甲基化狀態(tài)關(guān)系不大［9］。有研究顯示，MGMT基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的敏感性密切相關(guān)，其啟動(dòng)子甲基化使MGMT失活，38.8%DLBCL患者的MGMT啟動(dòng)子甲基化，甲基化狀態(tài)與OS正相關(guān)［10］。MGMT啟動(dòng)子甲基化在DLBCL患者中達(dá)52.3%，啟動(dòng)子甲基化與化療療效和DFS無(wú)關(guān)，但MGMT甲基化是DLBCL的有意義的預(yù)后因素［11］。本研究中30例DLBCL患者化療前血漿甲基化 MGMT基因的表達(dá)率為63.3%，MGMT DNA甲基化者化療有效率為100.0%，而MGMT DNA非甲基化者有效率為72.7%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

本研究結(jié)果顯示，檢測(cè)血漿甲基化MGMT基因表達(dá)與DLBCL患者使用CHOP方案治療的療效相關(guān)，血漿甲基化MGMT基因表達(dá)可能成為DLBCL患者個(gè)體化化療的有用指標(biāo)，檢測(cè)血漿甲基化MGMT基因更便于動(dòng)態(tài)觀(guān)察，更方便在腫瘤治療過(guò)程中根據(jù)其表達(dá)的變化選擇個(gè)體化化療方案，提高化療效果。

［1］ House MG，Guo M，Iacobuzio-Donahue C，et al.Molecular progression of promoter methylation in intraductal papillary mucinous neoplasms(IPMN)of the pancreas［J］.Carcinogenesis，2003，24(2)∶193-198.

［2］ Passagne I，Evrard A，Depeille P，et al.O(6)-methylguanine DNA-methyltransferase(MGMT)overexpression in melanoma cells induces resistance to nitrosoureas and temozolomide but sensitizes to mitomycin C ［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，211(2)∶97-105.

［3］ Blough MD，Zlatescu MC，Cairncross JG.O6-methylguanine-DNA methyltransferase regulation by p53 in astrocytic cells［J］.Cancer Res，2007，67(2)∶580-584.

［4］ Everhard S，Kaloshi G，Criniere E，et al.MGMT methyration:a marker of response to temozolomide in low grade gliomas［J］.Ann Neurol，2006，60(6)∶740-743.

［5］ Hiraga J，Kinoshita T，Ohno T，et al.O6-methylguanine-DNA methyltransferase and p53 mutation in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Int J Hematol，2006，84(3)∶248-255.

［6］ Balana C，Ramirez JL，Taron M，et al.O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase methylation in serum and tumor DNA predicts response to 1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea but not to temozolamide plus cisplatin in glioblastoma multiforme［J］.Clin Cancer Res，2003，9(4)∶1461-1468.

［7］ Ohno T，Hiraga J，Ohashi H.Loss of O6-methylguanine-DNA methyltransferase protein expression is a favorable prognostic marker in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Int J Hematol，2006，83(4)∶341-347.

［8］ Pike BL，Greiner TC，Wang X，et al.DNA methylation profiles in diffuse large B-cell lymphoma and their relationship to gene expression status［J］.Leukemia，2008，22(5)∶1035-1043.

［9］ Uccella S，Cerutti R，Placidi C，et al.MGMT methylation in diffuse large B-cell lymphoma:validation of quantitative methylation-specific PCR and comparison with MGMT protein expression［J］.J Clin Pathol，2009，62(8)∶715-723.

［10］ Hiraga J，Kinoshita T，Ohno T，et al.Promoter hypermethylation of the DNA-repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase and p53 mutation in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Int J Hematol，2006，84(3)∶248-255.

［11］ Lee SM，Lee EJ，Ko YH，et al.Prognostic significance of O6-methylguanine DNA methyltransferase and p57 methylation in patients with diffuse large B-cell lymphomas［J］.APMIS，2009，117(2)∶87-94.