HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方利血平片中苯磺酸氨氯地平和纈沙坦含量

張 芳(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，呼和浩特 010050)

復(fù)方制劑由于藥物間產(chǎn)生協(xié)同作用，從而減少不良反應(yīng)和用藥制劑的數(shù)量，改善患者的順應(yīng)性，正日益受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。由于復(fù)方制劑成分較復(fù)雜，且各成分理化性質(zhì)不同，其含量測(cè)定較為困難。本文中的復(fù)方抗高血壓藥由鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦2種活性成分組成，該復(fù)方制劑中各單一成分的含量測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，但2種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的方法還未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)大量試驗(yàn)，建立了一種用高效液相色譜法法同時(shí)測(cè)定復(fù)方利血平片中2個(gè)主要成分的含量的方法，為該類(lèi)制劑研究質(zhì)量控制中含量測(cè)定方法提供了一種思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號(hào):Agilent1100;生產(chǎn)廠家:安捷倫公司)，包括泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD紫外檢測(cè)器、HP化學(xué)工作站;電子分析天平(型號(hào):AL104;生產(chǎn)廠家:梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:苯磺酸氨氯地平和纈沙坦對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為:100374-200602和100651-200401;樣品:復(fù)方利血平片，自制，批號(hào)分別為:090601、090602、090603;甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6 ×250 mm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸(70∶30);檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm;流速:1 mL·min－1;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣體積:20 μL[1，2]。

2.2 溶液的制備及測(cè)定方法

2.2.1 供試品溶液的制備:取本品10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量(約相當(dāng)于纈沙坦40 mg)，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相80 mL，超聲處理10 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液[1，2]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備:取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品與纈沙坦對(duì)照品各適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1 mL含苯磺酸氨氯地平3.5 μg、纈沙坦80 μg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 測(cè)定方法:精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色圖譜，計(jì)算理論塔板數(shù)，分離度。結(jié)果在選定的色譜條件下，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，理論板數(shù)按苯磺酸氨氯地平和纈沙坦峰計(jì)算，均在3 000以上，且2種成分與相鄰色譜峰的分離度均符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)附錄的規(guī)定[3]。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

按處方比例，制備空白輔料及缺苯磺酸氨氯地平和缺纈沙坦的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備上述陰性樣品溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果空白輔料及陰性樣品對(duì)2組分測(cè)定均無(wú)影響。對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.5 色譜條件的系統(tǒng)適用性考察

為了進(jìn)一步考察本色譜條件的系統(tǒng)適用性，考察了本品在劇烈條件下的降解情況，用高溫、酸、堿、氧化等方式對(duì)本品進(jìn)行破壞后，考察對(duì)主要成分的分離效果。結(jié)果:本品中的苯磺酸氨氯地平和纈沙坦2種成分與所有破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)的分離度均大于1.5，符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)附錄ⅤD法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求;說(shuō)明本色譜條件可作為本制劑的含量測(cè)定方法[3]。

2.6 線性范圍的考察

精密稱(chēng)取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品和纈沙坦對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1 mL溶液中含苯磺酸氨氯地平17.34 μg和纈沙坦0.401 5 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述溶液 1、2、4、6、8、10 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積作縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程[苯磺酸氨氯地平:Y=198 3.84X－1.79(r=0.999 94);纈沙坦:Y=2 104.98X+9.87(r=0.999 99)]，結(jié)果表明:苯磺酸氨氯地平在0.017 34～0.173 4 μg、纈沙坦在 0.401 5 ～4.015 μg 范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果苯磺酸氨氯地平RSD=0.44%，纈沙坦RSD=0.15%。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2 項(xiàng)”下的供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果苯磺酸氨氯地平 RSD=0.79%，纈沙坦RSD=0.17%。結(jié)果表明:供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品(批號(hào):090603)粉末適量(約相當(dāng)于纈沙坦40 mg)，平行稱(chēng)取6份，照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，結(jié)果苯磺酸氨氯地平RSD=1.81%，纈沙坦RSD=1.45%。

2.10 回收率試驗(yàn)

按處方比例，稱(chēng)取空白輔料9份，分別置100 mL量瓶中，分別精密加入纈沙坦對(duì)照品和苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，加流動(dòng)相適量，超聲處理10 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，以下操作按“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.11 耐用性試驗(yàn)

在選定的色譜條件的基礎(chǔ)上，分別考察了不同型號(hào)的色譜柱及改變流動(dòng)相比例，對(duì)2組分分離效果及含量的影響。色譜柱試驗(yàn)了 Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6×250 mm)和 Agilent Eclipse XDB C18(5 μm，4.6×250 mm，)，結(jié)果分離效果基本一致。流動(dòng)相比例分別試驗(yàn)了甲醇-0.2%磷酸75∶25、70∶30 和65∶35，結(jié)果 2 組分的分離效果及含量基本一致，表明色譜條件稍有改變，不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

2.12 定量限檢測(cè)

因處方中苯磺酸氨氯地平量較少，故對(duì)其定量限進(jìn)行了考察。方法:精密稱(chēng)取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1 mL含0.88 μg的溶液，分別精密吸取此溶液 2、5、10、20 μL，注入液相色譜儀，按《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)附錄對(duì)定量限確定的要求，以信噪比10∶1時(shí)的進(jìn)樣量來(lái)確定，結(jié)果進(jìn)樣量為0.008 8 μg時(shí)符合要求，并對(duì)精密度試驗(yàn)進(jìn)行了考察，即配制了每1 mL含0.43 μg的苯磺酸氨氯地平對(duì)照品溶液，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD=0.99%。結(jié)果表明:檢測(cè)的精密度較好，符合定量限要求，故確定苯磺酸氨氯地平的定量限為0.008 8 μg[3]。

2.13 樣品測(cè)定

對(duì)3批樣品按擬定的含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算標(biāo)示量的百分含量，3批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 2 Determination results of the contents of three batches of samples(n=3)

3 討論

3.1 復(fù)方抗高血壓藥的臨床應(yīng)用趨勢(shì)

對(duì)于許多高血壓患者，僅僅使用單方難以控制的高血壓，這就需要作用機(jī)理不同的抗高血壓藥聯(lián)合使用把血壓降到預(yù)期的效果，這樣不僅可以減少由于單方時(shí)增加藥物劑量帶來(lái)的不良反應(yīng)，而且降壓效果會(huì)比其中的任何單方強(qiáng)，復(fù)方制劑消除聯(lián)合用藥的麻煩，也減少了漏服的可能性。有研究表明，近80%的高血壓患者需要多藥聯(lián)合治療，以幫助血壓達(dá)標(biāo)。對(duì)于那些需要多種藥物治療的患者，采用固定復(fù)方制劑作為一線治療方案可以避免由一種藥物開(kāi)始治療，接著增加劑量，繼而再加用另一種藥物的階梯治療方案，從而可以減輕患者的用藥治療負(fù)擔(dān)，目前聯(lián)合用藥是國(guó)際和我國(guó)高血壓防治指南共同提倡的。所以，復(fù)方制劑的研究對(duì)增加療效準(zhǔn)確、適應(yīng)證廣的抗高血壓藥新品種，更好地滿(mǎn)足臨床需求有著重要意義[4-7]。

3.2 含量測(cè)定方法選擇

在選擇色譜條件時(shí)，流動(dòng)相的選擇首先參照苯磺酸氨氯地平和纈沙坦原料及單方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，流動(dòng)相曾試驗(yàn)了乙腈-水-冰醋酸(500∶500∶1)、甲醇-0.03 mol·L－1磷酸二氫鉀(75∶25)、乙腈-0.2%磷酸及乙腈-0.2%磷酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值)等系統(tǒng)及不同比例，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸(三乙胺調(diào)節(jié)PH值為2～3)分離效果較好，后又試驗(yàn)了甲醇-0.2%磷酸(70∶30)，結(jié)果分離效果較好，且2組分的保留時(shí)間適宜，故將此流動(dòng)相收入正文。在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，經(jīng)光譜圖考察、纈沙坦在250 nm有最大吸收，而苯磺酸氨氯地平在237 nm有最大吸收，因處方中纈沙坦處方量較苯磺酸氨氯地平的大，故選擇237 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)檢測(cè)2種成分;而在此波長(zhǎng)處，纈沙坦也有較強(qiáng)的吸收。在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)提取溶劑及提取方法進(jìn)行了選擇。提取溶劑根據(jù)苯磺酸氨氯地平和纈沙坦的理化性質(zhì)，并參照文獻(xiàn)，曾試驗(yàn)了以甲醇和流動(dòng)相為溶劑，結(jié)果:甲醇和流動(dòng)相為溶劑時(shí)，2種成分的含量稍有差異，并且以甲醇為溶劑時(shí)，苯磺酸氨氯地平和纈沙坦的理論板數(shù)較低，且峰形均較差，故選擇流動(dòng)相作為提取溶劑。提取方法參照苯磺酸氨氯地平和纈沙坦單方制劑原標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下均采用超聲處理方法進(jìn)行提取效果較好。超聲時(shí)間分別試驗(yàn)了10、20、30 min，結(jié)果無(wú)明顯差別，故選擇超聲10 min即可。

該方法通過(guò)對(duì)精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率試驗(yàn)及3批樣品中苯磺酸氨氯地平及纈沙坦的含量測(cè)定，證明本方法作為該藥品含量測(cè)定方法，能夠保證檢測(cè)時(shí)數(shù)據(jù)的真實(shí)性、可靠性，可有效控制該制劑含量，能夠作為保證藥品質(zhì)量的檢測(cè)依據(jù)。

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