p53在肝癌干細胞中的表達情況

胡文秀，郝靜云，韓志強

(內蒙古醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，呼和浩特010050)

干細胞可以生成多向分化潛能的前體細胞、定向前體細胞和已分化的成熟細胞［1］。肝內干細胞，又稱為肝臟前體細胞，是核卵圓形、胞質很少且嗜酸性的一類小細胞，其特征不同于肝細胞和膽管上皮細胞。它們具有多向分化潛能，可以分別通過生成中間過渡細胞——肝細胞樣細胞和膽管樣細胞［2，3］，分化為肝細胞和膽管上皮細胞。與動物模型中誘導出的“卵圓細胞”及其子細胞相比，許多研究者發(fā)現(xiàn)人類肝臟前體細胞也有與之有超微結構相似的三種子細胞:最原始的前體細胞，存在于肝板竇狀隙;肝細胞樣細胞，存在于肝細胞之間;膽管上皮樣細胞，存在于匯管區(qū)。免疫組化檢測單抗OV-6可以有助于識別這些細胞［1］，OV-6是檢測肝內干細胞的特異性抗體。越來越多的證據(jù)證明肝臟前體細胞可以生成腫瘤。在動物模型中發(fā)現(xiàn)肝臟前體細胞的雙向分化潛能與肝細胞肝癌的發(fā)生有關［4］。而且在人類大多數(shù)肝臟疾病中，人們發(fā)現(xiàn)肝臟前體細胞與肝細胞肝癌的發(fā)生有潛在的關系，并且其數(shù)量與肝臟疾病最終發(fā)生腫瘤的危險性呈正相關［5］。

由于干細胞可以自我更新，所以它們也有可能在致癌物的作用下發(fā)生突變。在人類肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中，肝臟前體細胞發(fā)揮作用的機制還不甚了解。國內外學者通過對在干細胞內的重要抑癌基因——p53的突變檢測而從抑癌基因方面研究干細胞的致瘤性問題［6，7］。但p53在人類肝細胞肝癌中的表達情況尚沒有報道。本實驗的目的在于檢測在人類肝細胞肝癌中是否存在干細胞，通過檢測p53在肝細胞肝癌中的表達情況以探索肝內干細胞與腫瘤的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2000～2008年內蒙古醫(yī)學院普外科及外科收治的肝癌患者117例，術前未經(jīng)放療、化療。所有患者均經(jīng)病理檢查診斷為肝細胞肝癌。標本離體后立即取材，并以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。

1.2 主要試劑 HepParl和p53抗體購自Zymed公司，OV-6抗體購自R＆D公司。免疫組織化學SP法檢測試劑盒以及DAB染色試劑盒均購自福建邁新生物工程有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟包埋組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，采用常規(guī)SP免疫組織化學方法檢測HepParl(肝細胞的標志物)、OV-6(干細胞的標志物)以及p53的蛋白表達情況。

p53為核表達，采用半定量計分法，選擇具有代表性的3個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細胞。根據(jù)著色細胞占計數(shù)細胞的百分率分為:﹤50%為低表達，≥50%為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析，p53表達結果采用百分比進行描述，使用Kappa檢驗分析兩組表達的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HepParl和OV-6的表達情況 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)肝內干細胞散在分布于肝癌組織中或在腫瘤結節(jié)邊緣成單排或雙排索狀分布，排列成狹窄的小管樣結構與門脈區(qū)膽管相連。肝內干細胞體積較小，細胞質少，細胞核呈卵圓形，核/質比大。在117例肝癌組織中均可見到HepParl和OV-6表達陽性的肝內干細胞(圖1和圖2)。腫瘤細胞呈HepParl陽性表達，但OV-6呈陰性表達。

圖2 OV-6在肝細胞肝癌中的表達

2.2 p53的表達情況 p53呈細胞核表達。在117例肝細胞肝癌組織中，p53在腫瘤細胞中高表達者為38例(32%)，而且陽性細胞主要集中于腫瘤結節(jié)邊緣。p53在干細胞高表達者為36例(31%)，表達部位接近于腫瘤結節(jié)的邊緣。p53在腫瘤細胞和干細胞的表達情況具有一致性(Kappa=0.526，P=0.000)。具體表達情況見圖3和表1。

圖3 p53在肝細胞肝癌中的表達情況

表1 p53在腫瘤細胞和干細胞中的表達情況

3 討論

人們在許多實體腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)了干細胞的存在，雖然在不同的腫瘤干細胞的來源不同。存在于肝臟赫令管的肝內干細胞［2，8］，又稱為肝臟前體細胞。在人類正常肝臟中，正常的干細胞通常處于靜止狀態(tài)，處于G0期［1］，而且很難檢測到。只有當肝臟嚴重受損大量的肝細胞丟失并且其余的肝細胞在肝毒素或致癌物的作用下增殖受到抑制時，干細胞才會被激活，大量地存在于肝小葉周圍的匯管區(qū)內。越來越多的證據(jù)表明，不論在動物致癌模型中［9］還是人類腫瘤中［10，11］，肝內干細胞與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系。與文獻報道基本一致，在肝細胞肝癌組織中，可以檢測到肝內干細胞。肝內干細胞散在分布于肝癌組織中或在腫瘤結節(jié)邊緣成單排或雙排索狀分布，排列成狹窄的小管樣結構與門脈區(qū)膽管相連。肝內干細胞體積較小，細胞質少，細胞核呈卵圓形，核/質比大。

在人體中，肝臟再生早期，肝臟前體細胞表達OV-6、CK7和chrom-A的免疫活性。在雙向分化期，肝臟前體細胞向膽管上皮樣細胞和肝細胞樣細胞分化，并分別呈現(xiàn)出 OV-6、CK7、CK19、chrom-A 以及OV-6、chrom-A的活性增強［2］。由于干細胞可以自我更新，所以它們也有可能在致癌物的作用下發(fā)生突變。研究發(fā)現(xiàn)，一個發(fā)生突變的干細胞會生成其他突變的干細胞并發(fā)生異常增殖，形成癌前病變。多次的突變最終會導致干細胞群增殖旺盛，凋亡下降，免疫逃避以及生長過度，出現(xiàn)典型的惡性腫瘤的特征［1］。但是或許有人會質疑:肝內干細胞只是腫瘤組織中的一小部分細胞，它們怎么會增殖最后生成腫瘤呢?已經(jīng)有人作過這方面的研究，證明雖然干細胞只占腫瘤組織的一小部分，但是它們卻有生成腫瘤細胞的能力，而大多數(shù)腫瘤細胞卻沒有。近來研究顯示，干細胞可以是肝癌的重要的治療靶點［2］。

在肝細胞肝癌中，通常有p53抑癌基因的突變。p53基因突變可以使細胞異常生長，最終使細胞基因轉變，發(fā)生腫瘤。由于野生型p53蛋白的半衰期很短，用免疫組化所檢測的p53蛋白幾乎都是突變型p53蛋白。在本實驗中，31%(38/123)的肝細胞肝癌表達突變型p53蛋白，此百分比接近于腫瘤結節(jié)周圍的前體細胞的突變型p53蛋白的表達陽性率，兩者具有相關性。在形態(tài)學表現(xiàn)上，p53高表達的干細胞主要集中于腫瘤結節(jié)邊緣，并且附近的腫瘤細胞也呈現(xiàn)p53表達的趨勢，雖然不一定是p53高表達。由此，是否可以大膽猜測:干細胞是癌細胞的起源細胞，肝細胞肝癌的發(fā)生過程可能是正常肝內干細胞長期突變積累的過程。

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