海洋來(lái)源真菌Fusarium sp.次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究(Ⅱ)

劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會(huì)明

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計(jì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.青島科技大學(xué)，山東 青島 266042)

近年來(lái)，海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究日趨活躍，其中海洋真菌更是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。海洋獨(dú)特的生存環(huán)境使海洋真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類(lèi)型及生物活性等方面都呈現(xiàn)出與陸生真菌不同的特點(diǎn)和多樣性，其在抗腫瘤、抗微生物等方面巨大的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用潛質(zhì)，引起了人們的極大關(guān)注[1]。

作者在此對(duì)海洋來(lái)源真菌Fusariumsp.菌絲體的丙酮提取物進(jìn)行了化學(xué)成分分離，通過(guò)波譜及理化性質(zhì)分析確定了這些化合物的結(jié)構(gòu)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

鐮孢霉屬真菌Fusariumsp.于2007年4月分離自南海潮間帶紅樹(shù)植物正紅樹(shù)(Rhizophoraapiculata)根際泥，由國(guó)家海洋局第一海洋研究所、青島科技大學(xué)田黎教授鑒定。菌株編號(hào)：HTTM-Z07006，存放于科技部資助的國(guó)家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫(kù)。

實(shí)驗(yàn)所用試劑為分析純或色譜純。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖17 g，NaCl 15 g，MgCl2·6H2O 1 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL。

開(kāi)放ODS柱色譜填料(100 μm)，日本YMC公司；Sephadex LH-20，GE Healthcare公司；柱色譜硅膠(200～300目)、薄層色譜硅膠，青島海洋化工廠；Bruker ARX-300、AV-600型核磁共振儀；L2130型HPLC(檢測(cè)器為HITACHI L 2400 型)，日本HITACHI公司；YMC-Pack ODS-AM(10 mm×250 mm)。

1.2 方法

取菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，24 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 d，發(fā)酵量60 L。

發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過(guò)濾，分離得到濾液和菌絲體。菌絲體(濕重1906.5 g)經(jīng)反復(fù)冷凍-融化處理后，用4 BV丙酮超聲提取3次，每次提取1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏81.5 g。菌絲體丙酮提取物經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇[(100∶0)～(0∶100)]梯度洗脫，得到282個(gè)流分(500 mL/流分)。

第33～55流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第20～31亞流分經(jīng)Sephadex LH-20柱進(jìn)一步純化，得到化合物1(2 mg)。

第73～84流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用甲醇洗脫，第12亞流分經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物6(5 mg)；第26～27亞流分合并得到化合物2(2 mg)。

第51～57流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第20～22亞流分合并，用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫及Sephadex LH-20柱色譜，得到化合物7(2 mg)和9(10 mg)。

第124～135流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第11亞流分得到化合物3(4 mg)；第16～19亞流分合并，經(jīng)純化得到化合物8(5 mg)。

第136～149流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第14、15亞流分得到化合物10(30 mg)。

第180～188流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第19～25亞流分得到化合物4(6 mg)。

第195～210流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，第26～43亞流分經(jīng)開(kāi)放ODS色譜柱，用甲醇-水(5%，10%)洗脫，得到化合物5(8 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物1：桔黃色針晶(甲醇)，UV 365 nm下有桔紅色熒光，Borntr?ger′s反應(yīng)陽(yáng)性。IR(KBr)，ν,cm-1：3424(OH)，1628(締合C=O)；1HNMR(600 MHz，DMSO-d6),δ,ppm:12.12(1H，s，5-OH)，12.07(1H，s，1-OH)，11.40(1H，br s，3-OH)，7.53(1H，d，J=1.2 Hz，H-8)，7.20(1H，d，J=1.2 Hz，H-6)，7.14(1H，d，J=2.1 Hz，H-4)，6.60(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，2.43(3H，s，7-CH3)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[2]，鑒定該化合物為1，3，5-三羥基-7-甲基蒽醌(1，3，5-Trihydroxyl-7-methylanthraquinone)。

化合物2：桔黃色無(wú)定形粉末，UV 365 nm下有桔紅色熒光，Borntr?ger′s反應(yīng)陽(yáng)性。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：12.16(2H，br s，1，8-OH)，7.66(1H，br s，H-4)，7.26(1H，br s，H-5)，7.12(1H，br s，H-2)，6.56(1H，br s，H-7)，5.56(1H，br s，CH2OH)，4.61(2H，d，J=4.7 Hz，CH2OH)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[3]，鑒定該化合物為6-羥基蘆薈大黃素(Citreorosein)。

化合物3：白色無(wú)定形粉末，10% 硫酸乙醇顯紫色，Molish反應(yīng)陽(yáng)性。1HNMR(600 MHz，C5D5N)，δ,ppm:5.33(1H，br s，H-6)，5.23(1H，q，J=6.6 Hz，H-28)，5.07(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.58(1H，dd，J=12.0 Hz，2.4 Hz，H-6′a)，4.43(1H，dd，J=12.0 Hz，5.4 Hz，H-6′b)，4.32(1H，dd，J=9.0 Hz，8.0 Hz，H-4′)，4.30(1H，dd，J=9.0 Hz，8.0 Hz，H-3′)，4.08(1H，t，J=7.8 Hz，H-2′)，4.01(1H，m，H-3)，3.95(1H，m，H-5′)，1.02(3H，d，J=7.2 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-19)。13CNMR(150 MHz，C5D5N),δ,ppm:145.9(C-24)，140.9(C-5)，121.9(C-6)，117.1(C-28)，102.6(C-1′)，78.7(C-3′)，78.5(C-5′)，78.1(C-3)，75.4(C-2′)，71.8(C-4′)，62.9(C-6′)，56.8(C-14)，56.2(C-17)，50.4(C-9)，42.5(C-13)，40.0(C-4)，39.4(C-12)，37.5(C-1)，37.0(C-10)，36.5(C-20)，36.4(C-22)，32.2(C-8)，32.1(C-7)，30.3(C-2)，28.9(C-25)，28.5(C-23)，28.4(C-16)，24.5(C-15)，21.3(C-27)，21.2(C-26)，21.2(C-11)，19.5(C-19)，19.0(C-21)，13.0(C-29)，12.0(C-18)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[4，5]，鑒定該化合物為 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-豆甾-5，24(28)Z-二烯(3-O-β-D-Glucopyranosyl-stigmasta-5，24(28)Z-diene)。

化合物4：無(wú)色針晶(甲醇)，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：11.31(1H，s，NH)，7.88(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.77(1H，d，J=5.4 Hz，H-1′)，5.62(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，5.37(1H，d，J=5.7 Hz，OH)，5.09(2H，m，OH)，4.01(1H，m，H-3′)，3.94(1H，m，H-2′)，3.82(1H，m，H-4′)，3.60(1H，m，H-5′a)，3.53(1H，m，H-5′b)。與尿嘧啶核苷對(duì)照品共薄層，多種溶劑系統(tǒng)下Rf值一致，并結(jié)合文獻(xiàn)[6]，鑒定該化合物為尿嘧啶核苷(Uridine)。

化合物5：白色無(wú)定形粉末，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:12.42(1H，br s，NH)，8.35(1H，s，H-2)，8.08(1H，br s，H-8)，5.86(1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，4.48(1H，m，H-3′)，4.12(1H，m，H-2′)，3.93(1H，m，H-4′)，3.64(1H，m，H-5′a)，3.55(1H，m，H-5′b)。13CNMR(75 MHz，DMSO-d6)，δ,ppm:61.4(C-5′)，70.4(C-3′)，74.2(C-2′)，85.7(C-4′)，87.5(C-1′)，124.5(C-5)，138.8(C-2)，146.0(C-8)，148.3(C-4)，156.6(C-6)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[7]，鑒定該化合物為次黃嘌呤核苷(Inosine)。

化合物6：無(wú)色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:8.09(1H，s，NH)，4.12(1H，m，H-6)，4.00(1H，d，J=16.8 Hz，H-3a)，3.50(1H，dd，J=4.8 Hz，16.8 Hz，H-3b)，3.37(2H，m，H-9)，2.12(1H，m，H-7a)，1.82(3H，m，H-7b，H-8)。13CNMR(150 MHz，DMSO-d6)，δ,ppm:169.3(C-2)，163.9(C-5)，58.1(C-6)，46.0(C-3)，44.7(C-9)，27.9(C-7)，22.1(C-8)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[8]，鑒定該化合物為吡咯并哌嗪-2，5-二酮(Pyrrolopiperazine-2，5-dione)。

化合物7：無(wú)色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：7.95(1H，s，NH)，4.12(1H，m，H-6)，3.92(1H，br s，H-3)，3.34(2H，m，H-9)，2.34(1H，m，H-10)，2.13(1H，m，H-7a)，1.82(3H，m，H-7b，H-8)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，H-11 or H-12)，0.85(3H，d，J=6.6 Hz，H-12 or H-11)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[9]，鑒定該化合物為3-異丙基吡咯并哌嗪-2，5-二酮(3-Isopropylpyrrolopiperazine-2，5-dione)。

化合物8:白色無(wú)定形粉末，UV 254 nm下有明顯暗斑。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm：10.94(1H，s，NH)，10.75(1H，s，NH)，7.37(1H，d，J=7.7 Hz，H-6)，5.44(1H，d，J=7.7 Hz，H-5)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[10]，并與尿嘧啶對(duì)照品共薄層，Rf值一致，鑒定該化合物為尿嘧啶(Uracil)。

化合物10：無(wú)色針晶(甲醇)，1HNMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ，ppm:4.41(2H，d，J=5.6 Hz，OH)，4.33(2H，d，J=5.7 Hz，OH)，4.13(2H，d，J=7.1 Hz，OH)，3.59(2H，m，H-1a,H-6a)，3.52(2H，t，J=7.7 Hz，H-1b,H-6b)，3.43(2H，m，H-2,H-5)，3.36(2H，m，H-3,H-4)。13CNMR(150 MHz，DMSO-d6),δ,ppm:63.7(C-1,C-6)，69.6(C-3,C-4)，71.2(C-2,C-5)。綜合以上數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[13]，鑒定該化合物為甘露醇(Mannitol)。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)式

根據(jù)2.1分析結(jié)果，確定化合物1～10的結(jié)構(gòu)式如下：

3 結(jié)論

從海洋來(lái)源真菌Fusariumsp.的菌絲體中分離得到10個(gè)化合物，通過(guò)波譜和理化性質(zhì)分析，分別鑒定為1，3，5-三羥基-7-甲基蒽醌(1)、6-羥基蘆薈大黃素(2)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-豆甾-5，24(28)Z-二烯(3)、尿嘧啶核苷(4)、次黃嘌呤核苷(5)、吡咯并哌嗪-2，5-二酮(6)、3-異丙基吡咯并哌嗪-2，5-二酮(7)、尿嘧啶(8)、10S-羥基十八碳酸(9)、甘露醇(10)。其中化合物1、3和9均為首次從該屬真菌中分離得到。

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