潤滑油生物降解菌的篩選

沈齊英，艾 娃，林家柱，王 隆

(北京石油化工學(xué)院化工系，北京 102617)

目前全世界使用的潤滑油中，除部分由機械運轉(zhuǎn)正常消耗、部分回收再生利用外，在裝拆、灌注、機械運轉(zhuǎn)過程中仍有4%～10%的潤滑油流入環(huán)境，僅歐共體每年就有60萬t潤滑油由于各種原因流失在環(huán)境中。以礦物油作基礎(chǔ)油的傳統(tǒng)潤滑油產(chǎn)品，在自然環(huán)境中可生物降解能力差、滯留時間長，對環(huán)境造成破壞。

針對潤滑油造成的環(huán)境污染，世界各國都相繼進行了環(huán)境兼容潤滑油的研究，并積極研究石油基潤滑油的生物降解。所謂環(huán)境兼容潤滑油是指潤滑油在滿足機器工況要求的同時，潤滑油及其耗損產(chǎn)物對生態(tài)環(huán)境不造成危害或在一定程度上為環(huán)境所容許，即其生態(tài)效應(yīng)合格，其生態(tài)效應(yīng)最主要的指標(biāo)是潤滑油的生物降解性。目前為止還沒有一個普遍接受的測定潤滑油生物降解性的標(biāo)準(zhǔn)。國外在潤滑油生物降解性測試方法方面進行了大量的研究工作，先后發(fā)展出OECD、CEC-L-33-A-93等較成熟的測試方法。但用于評價潤滑油污染環(huán)境的實際狀況時還存在一定的不足，因此研究者正在對上述測試方法進行進一步的完善和發(fā)展，同時也在探索新的測試方法來評定潤滑油的生物降解性[1～3]。

作者從被石油基潤滑油污染的土壤中篩選獲得對潤滑油具有一定降解能力的菌株，并研究了菌株的生長特性，期望能為潤滑油生物降解性的評價提供可借鑒的數(shù)據(jù)及方法。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

菌源取自燕山石化被石油基潤滑油污染的土壤；潤滑油，燕山石化。

石油醚、葡萄糖和蔗糖，分析純，北京化工廠；苯胺，分析純，北京興津化工廠；蛋白胨、酵母粉和牛肉膏，北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

無機鹽培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基，參照文獻[4]配制。除無機鹽培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基在使用時均經(jīng)過0.15 MPa、121 ℃的蒸汽滅菌20 min。

AC2型生物安全柜，ESCD公司；sp-3000型紫外分光光度計，上海光學(xué)儀器廠；LGR10-4.2型冷凍離心機，北京醫(yī)用離心機廠；SPH-2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海世平實驗設(shè)備有限公司；DSX-280B型不銹鋼滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 潤滑油降解菌的馴化、分離和保存

取5 g被潤滑油污染的土壤充分溶于100 mL生理鹽水中，取10 mL接種于90 mL無機鹽培養(yǎng)基和10 mL潤滑油的混合液中，混合液置于恒溫振蕩器中，在120 r·min-1、28 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)48 h(1個周期)；取振蕩培養(yǎng)后水相液體10 mL，重新接種于90 mL無機鹽培養(yǎng)液和10 mL潤滑油的混合液中，在120 r·min-1、28 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)48 h；如此重復(fù)7個周期。

馴化7個周期結(jié)束后，水相液體以劃線分離的方法進行瓊脂平板分離菌種，再置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待瓊脂平板長出孤立菌落后，將孤立菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱保存[5，6]。

1.2.2 潤滑油降解菌的篩選

將保存在斜面培養(yǎng)基上的菌種接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在6000 r·min-1、15 ℃條件下離心分離收集菌體，制備0.5 g·mL-1菌懸液(0.5 g濕菌體懸于1 mL無機鹽培養(yǎng)基中)備用。

取100 mL菌懸液與5 mL潤滑油混合，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每24 h用10 mL石油醚萃取混合液的油相，并測定石油醚萃取液中潤滑油的含量。測得的潤滑油量越少，說明菌種降解潤滑油的效果越好，即為潤滑油降解菌。

苯胺在自然環(huán)境中可被多種微生物降解，故實驗中以苯胺作為陽性對照同時進行生物降解實驗，觀察實驗篩選的菌株對陽性有機物的降解能力[7]。

1.2.3 潤滑油降解菌的生長特性

選取溫度、pH值、NaCl濃度為主要影響因素設(shè)計潤滑油降解菌培養(yǎng)的正交實驗，因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素及水平

按正交表的設(shè)計配制培養(yǎng)基，接種相同菌量潤滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長處測定菌懸液的光密度值。菌懸液的濃度與光密度值成正比，光密度值大者可以認為其生長情況較好。

為了解菌株對環(huán)境酸堿及鹽濃度的耐受能力，調(diào)節(jié)富集培養(yǎng)基pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，接種相同菌量潤滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長處測定菌懸液的光密度值。

調(diào)節(jié)富集培養(yǎng)基的NaCl濃度(g·L-1)分別為5、10、15、20、25、26、27、28，接種相同菌量潤滑油降解菌，在120 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在690 nm波長處測定菌懸液的光密度值[8，9]。

1.3 分析與檢測

潤滑油和苯胺含量采用紫外分光光度法測定。掃描潤滑油和苯胺在紫外區(qū)的透過率，可知實驗中使用的潤滑油和苯胺均在320 nm波長處有較好的光吸收。根據(jù)320 nm波長處吸光度測定潤滑油和苯胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 潤滑油降解菌的馴化、分離和篩選結(jié)果

以被石油基污染的土壤為出發(fā)菌源、以潤滑油為限制性底物，通過增加環(huán)境選擇壓力的方法，馴化、分離、篩選出5株對潤滑油具有一定降解能力的菌株，分別標(biāo)記為RHY-1、RHY-2、RHY-3、RHY-4、RHY-5。菌種在液體培養(yǎng)基中均呈渾濁、懸浮生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，液體培養(yǎng)基的渾濁程度明顯增大。菌種的瓊脂平板形成乳白、濕潤、凸起的圓形菌落；革蘭氏染色可見菌體呈桿狀，G-，無芽孢，可初步鑒定為桿菌，其對潤滑油的降解能力見表2。

表2 菌株對潤滑油的降解能力

由表2可知，5菌株對潤滑油均有一定的降解能力，48 h的降解率分別為82.4 %、73.2%、72.6%、60.4%、53.8%，其中菌株RHY-1降解潤滑油的能力最強。

由表2還可知，降解48 h時的降解效率明顯高于24 h。這可能是因為，當(dāng)降解時間為24 h時，降解時間較短，菌體未能達到對數(shù)生長期。本實驗使用的石油基潤滑油基本未作處理，且無機鹽培養(yǎng)基中除潤滑油外無其它碳源，說明降解菌株能夠?qū)κ突鶟櫥瓦M行生物降解，且有較大范圍的環(huán)境耐受能力。

本實驗以被石油基潤滑油污染了的土壤為菌源，采用人工增加微生物生活環(huán)境中石油基潤滑油的方法，極大提高了土壤中微生物的選擇壓力，在多數(shù)微生物細胞被選擇掉的同時，幸存的微生物細胞從最初只能耐受石油基潤滑油的存在，到最后需要石油基潤滑油來維持其生長繁殖，使微生物產(chǎn)生了新性狀，即獲得能代謝石油基潤滑油的菌種。說明加入較高濃度石油基潤滑油形成較大的環(huán)境選擇壓力的方法簡單有效，是獲得新性狀菌種的較好方法。

2.2 潤滑油降解菌生長特性

選取降解潤滑油效果最好的菌株RHY-1進行正交實驗，結(jié)果與分析見表3。

表3 菌株RHY-1培養(yǎng)的正交實驗結(jié)果與分析

由表3可知,各因素對菌株RHY-1生長的影響大小依次為：pH值>溫度>NaCl濃度；菌株RHY-1在溫度為30 ℃、pH值為8.0、NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，生長狀況較好。

菌株RHY-1在不同pH值和鹽濃度下的生長情況見圖1和圖2。

圖1 菌株RHY-1在不同pH值下的生長情況

圖2 菌株RHY-1在不同鹽濃度下的生長情況

由圖1、圖2可知，菌株RHY-1可生長的pH值范圍為3.0～11.0，可以耐受的NaCl濃度為27 g·L-1，表明該菌株在環(huán)境pH值和鹽濃度改變較大時，仍能維持正常的生命活動，可以認為實驗獲得的潤滑油降解菌有較強的環(huán)境適應(yīng)能力。

3 結(jié)論

(1)以被石油基潤滑油污染的土壤為菌源，通過馴化、篩選、分離得到具有較強降解石油基潤滑油能力的菌株RHY-1；通過溫度、pH值和鹽濃度的3因素3水平的正交實驗及對環(huán)境pH值和鹽濃度的耐受實驗可知：菌株在溫度為30 ℃、pH值為8.0、NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，生長狀況較好；菌株耐受pH值的范圍為3.0～11.0，可耐受的NaCl濃度為27 g·L-1，具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力。

(2)采用增加環(huán)境選擇壓力的馴化方法,周期短，限制性底物用量少，獲得菌株降解潤滑油效果較好，可以認為是一種獲得新性狀菌種的較好方法，具有一定的實際應(yīng)用價值。

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