人非小細胞肺癌細胞的原代培養(yǎng)及個體化藥敏實驗研究

劉 浩 洪志鵬 尹小川 唐睿珠 郝 萍

肺癌(lung cancer)是人類最常見的惡性腫瘤之一。其中，80%的肺癌是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，而1/3的NSCLC病人就診時已屬晚期(Ⅲ、Ⅳ期)，近年來NSCLC的發(fā)病率持續(xù)升高，尤其是非吸煙人群中的婦女，其肺腺癌的發(fā)病率及細支氣管肺泡癌的發(fā)病率令人擔憂，其分子流行病學的原因尚未清楚，因此目前更加令人關(guān)注的是對NSCLC的治療。其中，化療在晚期NSCLC治療中起著重要作用。如何選擇對NSCLC有效的化療藥物，提高術(shù)后化療效果，并尋找用藥規(guī)律，一直是臨床腫瘤化療關(guān)注的問題。個體化化療是21世紀胸外科臨床發(fā)展的方向和理想的治療模式。我們采用MTT法對30例NSCLC進行體外原代細胞培養(yǎng)和藥物持續(xù)作用觀察，檢測其對5種化療藥物(長春瑞濱、依托泊苷、長春新堿、吉西他濱、多西他賽)的敏感性，并進行比較，希望能通過本課題的研究為肺癌個體化化療敏感藥物的選擇提供參考。

材料與方法

一、實驗材料

1.肺癌細胞

30例手術(shù)標本來自昆明醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院胸外科，病理確診為NSCLC。肺腺癌14例、肺鱗癌16例。其中，男性患者17例，女性患者13例，年齡36～68.歲，平均年齡51歲。

2.化療藥物

我們結(jié)合當前實際及常用化療方案從中選用五種化療藥，四種一線藥物長春瑞濱(NVP)、依托泊苷(VP-16)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)以及一種二線藥物多西他賽(TAX)。試驗藥物濃度即峰濃度(μg/mL)=(mg×平均體表面積/平均體重)×(100/60)其中mg為臨床用藥劑量(mg.kg-1.d-1)，國內(nèi)大多數(shù)教科書介紹體表面積的計算公式是:

SA=0.035W+0.1(W≤30)

1.05+(W-30)×0.02(W ＞30)

SA為人體表面積(m2);W為體重(kg);按照平均體重60 kg計算，平均體表面積為1.65?；熕幬锱渲茲舛燃爱a(chǎn)地，見表1。

表1 化療藥物配制濃度及產(chǎn)地Table 1 Confected concentration and origin of chemotherapeutics

3.主要試劑與儀器

RPMI-1640(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Amresco公司);淋巴細胞分離液:(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司);小牛血清:(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT(四甲基氮唑藍):(美國Amresco公司);DMSO:二甲基亞砜，分析純(美國Sigma公司);離心機(LXJ-II，TGL-16B，上海醫(yī)用分析儀器廠);超低溫冰箱(KK24E18TI，SIEMENS);電子天平(BP121S，Sartorius);CO2培養(yǎng)箱(HF240，Shanghai Lishen Scientific Equipment CO.Ltd);倒置光學顯微鏡(南京江南永新光學有限公司);96孔細胞培養(yǎng)板(Costar公司);酶聯(lián)免疫檢測儀((SYNTRON-MPR-2100，Thermo Labsystem公司);電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械七廠);蠕動泵(MILLPORE公司);微量振蕩器(MH-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

二、研究方法

1.制備單細胞懸液

取手術(shù)切除的新鮮癌組織約1.0 cm3大小，選取無壞死部分，盡量剔除纖維組織及黑色顆粒，立即浸入無菌培養(yǎng)瓶中，盡可能短時間(10 min內(nèi))轉(zhuǎn)運至實驗室。在超凈臺上，用無菌PBS液沖洗2次，無菌切除組織包膜，結(jié)締組織與壞死組織，剪成盡可能小的組織碎塊，大小約1 mm3。將組織小塊置于0.25%胰酶40 mL中，裝入培養(yǎng)瓶，置于37℃水浴箱中30 min，并不時搖動，使其充分消化，期間在鏡下觀察，當細胞變圓接近脫壁時，棄消化液，用10 mL完全－1640終止消化。用200目篩網(wǎng)將消化后的細胞懸液過濾收集，用無菌PBS液洗滌2次(離心，1500 r/min)，懸于20 mL完全-1640中，鏡下觀察細胞。于無菌離心管中依次輕輕加入100%及60%的淋巴細胞分離液各10 mL，其上再沿管壁輕輕加入細胞懸液(離心，2000 r/min，20 min)，收集60%分離液界面上的細胞，加5倍無菌PBS液(離心，2000 r/min，20 min)，去上清，加15 mL無菌PBS液，離心前進行細胞計數(shù)，再次離心，2000 r/min，20 min，去上清，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL ～2×105/mL。

2.實驗方法

種96孔板，分設(shè)加藥孔，陰性對照孔，空白孔，設(shè)3復孔。加藥孔與陰性對照孔，每孔100 μL細胞懸液，空白孔每孔100 μL完全 －1640，最后每孔補加100 μL完全 －1640，每孔終體積為200 μL。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加化療藥，加藥孔加20 μL化療藥，陰性對照孔加20 μL完全－1640，空白孔加20 μL完全－1640。將96孔培養(yǎng)板密封后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察48 h。每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，混勻，振蕩培養(yǎng)板10 min，使孔中沉淀完全溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以空白孔較0，以490 nm為測量波長，690 nm為參考波長，測每孔吸光度值(A值)。

計算活性抑制率:活性抑制率=(陰性對照組A值-加藥組A值)/陰性對照組A值×100%。當加藥組血漿高峰濃度水平時的抑制率大于50%時，即為高敏，小于30%為耐藥，介于兩者之間為中敏。

3.統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理分析，統(tǒng)計學方法采用完全隨機設(shè)計行×列表資料χ2檢驗，組間比較用四格表的確切概率法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

本實驗對30例非小細胞肺癌患者的癌細胞進行了體外藥物敏感性測定，結(jié)合當前臨床實際選用了5種化療藥，每種化療藥對非小細胞肺癌抑制率順序依次為TAX＞GEM＞NVB＞VP-16＞VCR(表2)，其總敏感率分別為100%、99%、62%、51%、32%，而高度敏感的敏感率分別為72%、63%、39%、35%、20%(表3)，提示肺癌對上述5種藥物均敏感。采用完全隨機設(shè)計行×列表資料的χ2檢驗分析表3，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。采用四格表的確切概率法進行兩兩比較，TAX和GEM治療NSCLC的有效率基本相同，可做為首選;而NVB、VP-16、VCR三藥兩兩比較，NVB與VP-16的有效率基本相同，VP-16與VCR的有效率基本相同，其中NVP的有效率高于VCR，VCR的高度敏感率不足30%，提示VCR治療效果差，。故治療NSCLC時應(yīng)首選TAX和GEM與鉑類藥物組合。五種化療藥對NSCLC的抑制率比較及治療NSCLC的敏感性比較分別見表2和表3。

討 論

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，約占所有腫瘤的12.4%，且發(fā)病率一直呈上升趨勢。近年來，雖然醫(yī)療診治水平有了較大的提升，但5年生存率仍不高［1］。中國預防醫(yī)學科學院衛(wèi)生信息中心公布，在21世紀，肺癌將成為中國居民的主要死因，肺癌將主導中國癌癥流行趨勢。而云南作為我國農(nóng)民肺癌高發(fā)地區(qū)，尤其女性肺癌病死率居全國首位，對肺癌的綜合治療顯得尤為重要。

臨床對肺癌的化療多憑經(jīng)驗給藥，而公式化的治療往往具有盲目性，造成多藥耐藥，不良反應(yīng)大，療效不佳的效果。有實驗結(jié)果證實［2］，用藥敏試驗結(jié)果指導臨床用藥治療的有效率要明顯高于不做藥敏試驗，憑經(jīng)驗給藥的對照組。

為進行NSCLC的個體化藥敏實驗研究，我們選擇了NSCLC細胞的原代培養(yǎng)，通過該方法獲得NSCLC細胞。這是本實驗成功的關(guān)鍵。我們總結(jié)幾點主要注意事項如下:①病例入選標準為患者年齡越小越好，最好選擇60歲以下的患者，以保證細胞的活力;盡可能地選擇無其他合并疾病特別是傳染病的患者，將細胞的污染機會降到最低;取材時應(yīng)保證無菌，避開纖維組織和壞死部位，如果腫瘤較大，最好取腫瘤的外周部分;②實驗前做到杜絕一切可能的污染是成功的關(guān)鍵;③取材后最好在30 min內(nèi)(最佳為10 min)送到實驗室開始實驗，這樣可以最大限度保證細胞的活力和數(shù)量;④腫瘤細胞的培養(yǎng)方法我們選擇酶消化法，該種方法可以將妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使細胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝產(chǎn)物，可以很快得到大量活細胞，細胞也可能在短時間內(nèi)生長成片。同時我們采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離純化肺癌細胞懸液，有文獻［3］證明采用梯度離心法收集純化癌細胞后再行MTT藥敏試驗，比傳統(tǒng)的方法藥敏陽性率有顯著提高(P＜0.01)，實驗收到了預期的效果。

20世紀80年代中期開始MTT法藥敏試驗首先應(yīng)用于急性白血病的治療中，指導臨床用藥，取得了良好的相關(guān)性和療效［4］。目前已逐步應(yīng)用到肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌等實體腫瘤的治療中，結(jié)果提高了藥物的選擇性，提高了化療質(zhì)量和化療個體化效果［5-8］。目前，該方法已廣泛應(yīng)用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。MTT法的特點是靈敏度高、重復性好、經(jīng)濟、快速、易自動化、無放射性污染、與其他體外藥物敏感試驗方法(如細胞計數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗和3H-TdR摻入試驗等)相比操作較簡單、實驗誤差減少，并且與臨床化療療效有較好的一致性［9］，利于臨床應(yīng)用，但尚存一些不足，有待克服。

表2 五種化療藥對NSCLC的抑制率比較Table 2 Comparison of inhibition ratio of five chemotherapeutics on NSCLC

表3 五種化療藥治療NSCLC的敏感性比較Table 3 Comparison of sensitivity among five chemotherapy agents on the treatment of NSCLC

腫瘤是一個異質(zhì)性、多形態(tài)、分化程度不等的細胞群體。腫瘤對各種化療藥物的敏感性存在著明顯個體差異。即不同的腫瘤類型或同一類型的不同病人，甚至同一病人在不同的發(fā)病階段，對化療的敏感性并不完全相同，治療效果差別也很大。至今還沒有一種化療藥物或幾種化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，能對某一種腫瘤 100% 有效［10，11］。

綜上所述，本課題之肺癌細胞原代培養(yǎng)的方法可獲得藥敏實驗所需的肺癌細胞。MTT法在原代肺癌細胞藥物敏感性試驗研究中值得推廣，可在基層醫(yī)院普及。30例非小細胞肺癌細胞對多西他賽與吉西他濱最敏感，可作為臨床治療NSCLC首選之一，該實驗方法也可作為NSCLC個體化治療的選擇之一。通過本課題的研究能為臨床NSCLC個體化化療提供參考。

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