卡泊芬凈合成前體Pneumocandin B0的發(fā)酵工藝研究

劉 靚，婁 忻，張 莉，關(guān)亞鵬

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心，河北 石家莊 050015)

卡泊芬凈(Caspofungin,代號MK-0991)是新型抗真菌化合物棘白霉素類中第一個用于臨床的藥物。2001年11月美國FDA和歐洲已批準(zhǔn)用于兩性霉素B治療無效或不能耐受兩性霉素B的侵襲性曲霉病患者[1]?？ú捶覂羰瞧暇厶呛铣擅敢种苿歉偁幮缘匾种普婢?xì)胞壁的1，3-β-D-葡聚糖的合成，從而發(fā)揮殺菌作用[2]，它是天然產(chǎn)物Pneumocandin B0的半合成衍生物。作者以Pneumocandin B0PB5-31為出發(fā)菌株，從選育高產(chǎn)菌株和提高產(chǎn)物中有效組分的比例兩方面進(jìn)行研究，以期提高Pneumocandin B0的發(fā)酵水平。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌株為Pneumocandin B0PB5-31。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)分離及斜面培養(yǎng)基：PDA 。

(2)種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉、蛋白胨、棉籽餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、玉米漿、碳酸鈣。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇、葡萄糖、棉籽餅粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

1.2.1.1 搖瓶種子培養(yǎng)

250 mL三角瓶內(nèi)裝40 mL培養(yǎng)基，接入成熟的斜面孢子，25 ℃、220 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)約48 h。

1.2.1.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

250 mL三角瓶內(nèi)裝40 mL培養(yǎng)基，接入成熟的種子，25 ℃、220 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)約180 h。測定發(fā)酵液效價。

1.2.2 菌種誘變與篩選

1.2.2.1 單孢子懸浮液制備

將Pneumocandin B0PB5-31孢子斜面加蒸餾水10 mL，制成孢子懸浮液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩，然后用玻璃纖維過濾，制成單孢子懸浮液，供誘變處理使用。

1.2.2.2 氯化鋰敏感度測試

選用氯化鋰濃度為0.40%、0.50%、0.60%進(jìn)行測試處理。氯化鋰與分離培養(yǎng)基按上述比例混合后，倒制平板，涂布孢子液。培養(yǎng)3～5 d，從菌落生長情況觀察其對氯化鋰的敏感度；10 d左右觀察菌落形態(tài)。挑選單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定效價，比較突變株和對照株。

1.2.2.3 紫外線誘變復(fù)合氯化鋰處理[3]

(1)紫外線誘變：取孢子懸浮液5 mL吸入已滅菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱應(yīng)至少提前30 min開啟)，平皿距離紫外燈28 cm，打開平皿蓋，紫外燈照射4 min，蓋上平皿蓋，取出。稀釋，涂布于空白培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

(2)氯化鋰前處理復(fù)合紫外線誘變：制成0.50%氯化鋰單孢子懸浮液，于25 ℃振蕩萌發(fā)孢子6 h，取10 mL吸入已滅菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱應(yīng)至少提前30 min開啟)，平皿距紫外燈28 cm處照射4 min，蓋上平皿蓋，取出。稀釋，涂布于空白培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

(3)紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理：將經(jīng)紫外誘變處理后的孢子液稀釋，涂布于上層含0.50%氯化鋰的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2.3 脯氨酸的添加

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加脯氨酸，添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，其它成分含量不變。搖瓶發(fā)酵，測定有效組分B0與無用雜質(zhì)A0(后續(xù)提取純化中很難分離)的比率，確定適宜的脯氨酸添加量。

1.2.4 樣品檢測

發(fā)酵液倒入刻度離心管中，3000 r·min-1離心10 min，取上清液HPLC檢測。沉淀部分所占體積與總?cè)芋w積的比值即為Pmv(%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯化鋰敏感度測試

以Pneumocandin B0PB5-31為出發(fā)菌株，用不同劑量的氯化鋰處理，結(jié)果見表1。

表1 氯化鋰敏感度測試結(jié)果/%

由表1可知，氯化鋰作為單一的因子，本身并無誘變作用。

2.2 紫外線誘變復(fù)合氯化鋰處理

以Pneumocandin B0PB5-31為出發(fā)菌株，分別采用單一紫外線誘變、氯化鋰前處理復(fù)合紫外線誘變、紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理，以未經(jīng)處理的單孢子懸浮液涂布于空白平板作為對照，結(jié)果見表2。

由表2可知，雖然氯化鋰本身并無誘變作用，但與紫外線誘變具有協(xié)同作用。氯化鋰前處理復(fù)合紫外線誘變和紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理誘變效果均好于單一紫外線誘變，且紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理效果更好，正向變異的幅度更大。

表2 紫外線誘變復(fù)合氯化鋰處理的結(jié)果

2.3 搖瓶篩選菌株比較

以Pneumocandin B0PB5-31為出發(fā)菌株，經(jīng)單一紫外線誘變處理后篩選出正突變率高的UV-Ⅰ突變株，經(jīng)氯化鋰前處理復(fù)合紫外線誘變、紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理分別篩選出正突變率高的LiCl-UV-Ⅱ突變株、UV-LiCl-Ⅲ突變株，與出發(fā)菌株P(guān)neumocandin B0PB5-31進(jìn)行對比，結(jié)果見表3。

表3 搖瓶篩選菌株比較

由表3可知，經(jīng)紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理篩選出的突變株UV-LiCl-Ⅲ的發(fā)酵水平最高，比出發(fā)菌株提高了72%。

2.4 脯氨酸添加量的影響(表4)

表4 脯氨酸添加量的影響

由表4可知，脯氨酸可以很好地提高有效組分B0的比例。當(dāng)脯氨酸添加量為0.3%時，B0∶A0最高，達(dá)3.28；繼續(xù)增大脯氨酸添加量，B0∶A0反而有所下降。

微生物代謝過程是一系列生化反應(yīng)的總和，因而在培養(yǎng)液中所分泌的代謝產(chǎn)物不可能是單一的化合物，而是一種混雜體。以抗生素而言，發(fā)酵液中包含有多種組分，雖然其分子結(jié)構(gòu)大同小異，但抗菌活性差異極大。生產(chǎn)所需要的產(chǎn)品成分為有效組分，而那些無抗菌活性及抗菌活性差的非產(chǎn)品成分則為雜質(zhì)。只有提高有效組分的比例，才可能提高成品的收率，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。提高發(fā)酵液中有效組分比例的方法有很多，本研究通過發(fā)酵培養(yǎng)基中適量添加脯氨酸提高了有效組分B0的比例。

3 結(jié)論

以Pneumocandin B0PB5-31為出發(fā)菌， 通過紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理篩選出高產(chǎn)菌株UV-LiCl-Ⅲ，其發(fā)酵效價比出發(fā)菌株提高了72%。表明紫外線誘變復(fù)合氯化鋰后處理是篩選獲得Pneumocandin B0高產(chǎn)菌株的有效手段。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.3%的脯氨酸很好地提高了有效組分B0的比例。

[1] New antimicrobial agents approved by the U.S.Food and Drug Administration in 2001 and new indications for previously approved agents[J].Antimicrob Agents Chemother，2002,46(4):1160.

[2] 高磊.新型抗真菌藥物—卡泊芬凈[J].臨床藥物治療雜志，2005，3(5)：55-58.

[3] 劉頤屏.抗生素菌種選育的理論和技術(shù)[J].中國醫(yī)藥科技出版社.

[4] 吳雪昌，汪志蕓，周婕，等.提高產(chǎn)抗生素鏈霉菌紫外誘變正變率的研究[J].遺傳，26(4)：499-504.