PHB產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的研究

涂 毅，王瑋玥，張 弘，魏 凱，來晨剛，曹軍衛(wèi)

(武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

由于石化塑料的難降解性，大量廢棄塑料流入自然界，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而聚-β-羥丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是一種在生態(tài)環(huán)境中能被完全降解為水和二氧化碳的生物材料，因此是一種可以替代石化塑料的理想的生物可降解塑料。PHB不僅可以用于輕工、化工、食品、農(nóng)業(yè)等現(xiàn)行的塑料應(yīng)用行業(yè)，還可用于醫(yī)療衛(wèi)生、高新技術(shù)產(chǎn)品研制等領(lǐng)域。

自1926年首次發(fā)現(xiàn)PHB以來，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，包括產(chǎn)生PHB的微生物，PHB的合成途徑、形成動(dòng)力學(xué)和機(jī)制，PHB的結(jié)構(gòu)、分子量及生物降解特性等多方面[1,2]。美、德、韓、奧地利等國(guó)都已廣泛開展PHB的研究[3,4]。國(guó)內(nèi)關(guān)于PHB研究的報(bào)道并不太多，上海有機(jī)所、中科院成都生物所、中科院微生物所、山東大學(xué)微生物系偶有PHB研究的信息[5～9]。能合成PHB的微生物分布極廣，包括自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能和化能菌等，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)共計(jì)65個(gè)屬中的多個(gè)種，其中既有革蘭氏陰性菌，也有革蘭氏陽性菌[10～15]。

PHB的分子量一般為106Da，熔點(diǎn)為180 ℃，具有高結(jié)晶性、光學(xué)活性和壓電性質(zhì)，是立體規(guī)整的聚合物。如果單體的碳鏈長(zhǎng)度增加，其柔韌性將會(huì)大大增強(qiáng)，而熔點(diǎn)及結(jié)晶度下降。PHB作為塑料，最好具有60萬Da以上的分子量[16]。

神農(nóng)架林區(qū)是一個(gè)有著豐富微生物資源的地區(qū)，本課題組從神農(nóng)架林區(qū)不同地點(diǎn)采集了多份土壤樣本，從中分離得到產(chǎn)生PHB的菌株，并探討了產(chǎn)PHB菌的最佳發(fā)酵條件，從而提高菌株的PHB積累量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株

從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

無氮培養(yǎng)基[17]：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，CaCO35 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0，113 ℃滅菌30 min。

平板培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，酵母膏 3 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)[14]：酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，硫酸銨5，葡萄糖10，pH值7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)[17]：蛋白胨5，酵母膏1，甘油5，葡萄糖5，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

將從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣分別標(biāo)記為1#、2#、3#、4#、5#、6#。每份土壤取少量加入50 mL的無菌生理鹽水，混勻，取10 mL上清液接入到無氮液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。

用10倍稀釋法將上述PHB產(chǎn)生菌富集液稀釋后接種到平板上，于30 ℃培養(yǎng)1～2 d后，挑取單菌落，接種到種子培養(yǎng)基中活化，32 ℃培養(yǎng)24 h后，在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值。然后接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃搖瓶培養(yǎng)144 h，不同時(shí)間取樣，測(cè)定生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量。

1.2.2 PHB的測(cè)定

取發(fā)酵液12 000 r·min-1離心收集細(xì)胞，用氯仿水浴加熱后，離心，取上清液，真空抽干氯仿，白色顆粒即為PHB粗提物。

PHB粗提物中加入10 mL濃硫酸，100 ℃加熱10 min，冷卻后在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值[17]。

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用L9(34)正交表，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)定碳源、氮源、pH值3因素3水平的9種不同配方配制培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)6 d，提取PHB后在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，確定產(chǎn)PHB菌的最適發(fā)酵條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與PHB的測(cè)定

按照1.2.1方法，從2#、3#、4#土樣中均分離到了單菌落，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，重新編號(hào)為SNJD-3-Ⅰ、SNJD-3-Ⅱ、SNJD-3-Ⅲ。培養(yǎng)后分別提取PHB，在235 nm波長(zhǎng)處都有吸收值，證明分離得到的三株菌都是產(chǎn)PHB的菌株。

挑取待測(cè)菌株，接種到種子培養(yǎng)基中活化，32 ℃培養(yǎng)24 h后，按照培養(yǎng)基體積5%接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃搖瓶培養(yǎng)。從第3 d起每天取樣提取PHB，測(cè)定OD235值；同時(shí)取樣測(cè)定560 nm處培養(yǎng)基的吸光值，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量的進(jìn)程曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 三株菌的PHB產(chǎn)量及其生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ菌株的PHB產(chǎn)量在培養(yǎng)至第6 d時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，PHB的積累量達(dá)到最大，第7 d明顯下降。SNJD-3-Ⅲ菌株的生長(zhǎng)在第5 d之后進(jìn)入衰亡期，可能由于SNJD-3-Ⅲ菌的穩(wěn)定期很短，不到24 h。而在菌株已經(jīng)進(jìn)入衰亡期后，PHB的積累量還在不斷增加。

2.2 菌種鑒定

取生長(zhǎng)比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性，桿菌，并有芽孢產(chǎn)生，初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

取生長(zhǎng)比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株進(jìn)一步研究。根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[17]，碳氮比大約為2∶1，因此按比例確定氮源為0.5 g、碳源為1.0 g，定容到50 mL。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件分析表2數(shù)據(jù)，繪制方差分析表，見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析

由表3可知，碳源、氮源、pH值3個(gè)因素中，氮源的P值<0.05，表明氮源的3個(gè)水平間有顯著差異，即氮源種類的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。因此，根據(jù)各因素的最優(yōu)水平，確定SNJD-3-Ⅰ培養(yǎng)的最佳條件是：葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，pH值為7.0。

在最佳條件下，32 ℃搖床培養(yǎng)6 d后提取PHB，測(cè)其OD235值為2.398，大于正交實(shí)驗(yàn)中9個(gè)不同培養(yǎng)條件下PHB的OD235值，說明在此最佳培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的菌株所積累的PHB的量最多，證明正交實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的結(jié)果確為SNJD-3-Ⅰ的最優(yōu)發(fā)酵條件。

對(duì)照PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷PHB含量[18]。根據(jù)測(cè)得的最佳培養(yǎng)條件下的PHBOD235值(2.398)， 計(jì)算得SNJD-3-Ⅰ菌株所積累的PHB量為14.72 g·L-1。

3 結(jié)論

從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離出了可以在細(xì)胞內(nèi)積累PHB的菌株，分析它們產(chǎn)生PHB的能力，并對(duì)其中3個(gè)菌株的生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量進(jìn)行比較，其中SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ的PHB積累量都在第6 d達(dá)到最大，第7 d明顯下降，而SNJD-3-Ⅲ的PHB產(chǎn)量在生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)明顯下降后仍呈上升趨勢(shì)。對(duì)SNJD-3-Ⅰ進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察其為革蘭氏陽性菌，桿菌，并有芽孢產(chǎn)生，初步鑒定為芽孢桿菌屬。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了SNJD-3-Ⅰ產(chǎn)PHB的最佳發(fā)酵條件，即以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源時(shí)，控制碳氮比為2∶1，pH值7.0，32 ℃振蕩培養(yǎng)6 d，在該條件下所積累的PHB量為14.72 g·L-1。

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