放線菌612243產(chǎn)除草活性代謝產(chǎn)物的研究

宗志友，周 瑜，徐文平，陶黎明

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237)

近年來(lái)，生物農(nóng)藥因其具有能克服化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和減少在農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量等優(yōu)勢(shì)，在病蟲(chóng)害綜合防治中的作用愈來(lái)愈重要，地位也愈來(lái)愈凸顯，其中微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥最重要的組成部分。

微生物農(nóng)藥主要包括活體微生物農(nóng)藥和農(nóng)用抗生素兩大部分[1]。農(nóng)用抗生素是在醫(yī)用抗生素的應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，最早人們嘗試用醫(yī)用土霉素、鏈霉素防治某些果樹(shù)、蔬菜上的病害，收到意想不到的效果，由此引發(fā)了農(nóng)用抗生素的研究，距今不過(guò)幾十年的歷史。日本的農(nóng)用抗生素研究發(fā)展最快，居于世界領(lǐng)先地位，先后開(kāi)發(fā)出了春日霉素、滅瘟素、多氧霉素、有效霉素、滅孢素等[3]。世界上許多國(guó)家如美、日、意、俄、丹麥、印度等已將農(nóng)用抗生素的研究列入國(guó)家發(fā)展的重點(diǎn)規(guī)劃中。近年來(lái)，我國(guó)也將生物農(nóng)藥列入國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展規(guī)劃，取得了很大的成績(jī)，生物農(nóng)藥的生產(chǎn)企業(yè)也達(dá)到一定的規(guī)模[4]。

作者在農(nóng)用抗生素篩選的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)一株放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有良好的除草活性，為此對(duì)這株微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了發(fā)酵和分離提取純化，獲得了一個(gè)除草活性化合物。在此報(bào)道了該化合物的結(jié)構(gòu)解析和生物活性研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、培養(yǎng)基和儀器

供試菌株612243，由上海南方農(nóng)藥研究中心分離純化自貴州高原地區(qū)的土樣；除草劑篩選靶標(biāo)均由上海南方農(nóng)藥研究中心提供。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖5，淀粉5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母膏1，瓊脂粉15，pH值自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：花生粉25，葡萄糖20，淀粉10，酵母膏4，氯化鈉1，牛肉膏1，磷酸氫二鉀0.005，pH值7.0～7.2。

Agilent1200MS-LC型液質(zhì)聯(lián)機(jī)色譜儀；東芝UV-2501PC型紫外全光譜掃描儀；Bruker Avance 500 MHz型核磁共振儀；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(英國(guó)質(zhì)譜公司Micromass GCTTM)；液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(英國(guó)質(zhì)譜公司Micromass LCTTM)等。

1.2 活性產(chǎn)物的分離純化

將培養(yǎng)好的斜面種子接種于已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)96 h，得到發(fā)酵液30 L。將發(fā)酵液于5000 r·min-1離心20 min，將沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡過(guò)夜。冷凍離心去除沉淀，將上清液減壓旋轉(zhuǎn)濃縮去除丙酮，然后與發(fā)酵液合并。用2 BV的正丁醇萃取3次，合并正丁醇相濃縮得到油狀物，再用甲醇溶解，過(guò)濾去除甲醇不溶物，濃縮去除甲醇，得黃褐色油狀物25 g。經(jīng)硅膠柱層析分離(以二氯甲烷∶甲醇為40∶1至1∶5的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫)，根據(jù)生物活性跟蹤結(jié)果，將活性部分濃縮，得淡黃色粉末狀固體1.1 g。用少量甲醇溶解，進(jìn)行TLC制備(以甲醇∶二氯甲烷=1∶40為展開(kāi)劑)，將Rf值為0.35的具有除草活性的條帶刮下，用無(wú)水甲醇浸泡2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至10 mL左右，再用制備型HPLC進(jìn)一步分離純化(制備柱型號(hào)：VP250/21 Nucleosil 100-7 C18，612243-B流動(dòng)相為甲醇∶水=75∶25，流速16 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm)。收集活性單峰，濃縮，得白色粉末狀純品612243-B 25.8 mg，純度為96%，對(duì)純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。整個(gè)分離純化過(guò)程以除草活性為生物活性跟蹤。

1.3 生物活性測(cè)定

除草活性初篩采用黃瓜、莧菜、油菜、馬唐、小麥和稗草的種子萌發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)。復(fù)篩采用鯉腸、莧菜、小藜、馬唐、狗尾和稗草的盆栽測(cè)定。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

將HPLC制備的活性組分612243-B溶解于0.5 mL CDCl3中，分別進(jìn)行核磁共振掃描。記錄1HNMR、13CNMR、DEPT90、DEPT135、COSY、NOESY、HMQC和HMBC等譜圖信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物612243-B結(jié)構(gòu)的確定

根據(jù)612243-B電噴霧質(zhì)譜圖(ESI)，可知612243-B[M+K+]=616、[M+Na+]=600、[M+H+]=578，計(jì)算出該物質(zhì)的分子量M=577。根據(jù)氮元素規(guī)則，分子中應(yīng)該含有奇數(shù)個(gè)氮原子。該化合物的相關(guān)核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。

表1 化合物612243-B的δC及其HMQC相關(guān)的δH

表2 化合物612243-B的1H-1H COSY和13C-1H HMBC信息/ppm

由表1、表2的數(shù)據(jù)可以確定化合物612243-B具有1個(gè)含4個(gè)雙鍵的17個(gè)C的長(zhǎng)鏈，1位C上有1個(gè)多位取代的吡啶基團(tuán)，10位C上有1個(gè)葡萄糖基團(tuán)，具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物612243-B的結(jié)構(gòu)式

查閱文獻(xiàn)[4，5]，確認(rèn)化合物612243-B為葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A)，分子式為C31H47NO9。

2.2 化合物612243-B生物活性分析

由于葡糖基殺粉蝶菌素是已知的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其除草活性，為此進(jìn)行了化合物612243-B的除草活性研究。離體除草活性生測(cè)采用杯碟法。具體生物活性見(jiàn)表3～表5。

表3 化合物612243-B的除草活性

表4 化合物612243-B莖葉處理鮮重防效結(jié)果

表5 化合物612243-B土壤處理結(jié)果

2.3 討論

經(jīng)文獻(xiàn)查閱，未發(fā)現(xiàn)Glucopiericidin A具有除草活性的報(bào)道。用化合物Glucopiericidin A對(duì)不同植物進(jìn)行莖葉處理時(shí)，該藥劑最佳起效時(shí)間為3 d左右，以后藥物可能被分解，植株主要表現(xiàn)為發(fā)黃、矮化、生長(zhǎng)較弱，且受濃度影響?；衔?12243-B施藥20 d后，未死植株長(zhǎng)勢(shì)慢慢恢復(fù)，比CK小，說(shuō)明施藥后抑制其生長(zhǎng)速度，會(huì)使雜草在與正常非靶標(biāo)植物競(jìng)爭(zhēng)中失去優(yōu)勢(shì)，營(yíng)養(yǎng)被作物奪取，達(dá)到施藥目的。施藥20 d的鮮重結(jié)果發(fā)現(xiàn)，612243-B土壤處理靶標(biāo)均無(wú)效果，而觀察莖葉處理后的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，612243-B對(duì)雙子葉靶標(biāo)的藥效要優(yōu)于禾本科靶標(biāo)。可以得出土壤處理的防效遠(yuǎn)低于莖葉處理的防效。這一結(jié)果可能與土壤吸附性或藥劑傳導(dǎo)性有關(guān)。

3 結(jié)論

在微生物農(nóng)藥的篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為612243的放線菌株可產(chǎn)生除草活性物質(zhì)。根據(jù)除草活性跟蹤的結(jié)果，將其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行溶劑萃取、層析及高效液相色譜制備等一系列的分離純化處理，獲得一個(gè)活性化合物612243-B。質(zhì)譜分析表明，該化合物分子量為577、分子式為C31H47NO9；經(jīng)其它光譜分析并對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，確定該化合物與已知的葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A)相同，但未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其除草活性的研究。

[1] 陳軼林，張承來(lái).微生物源活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與化學(xué)新農(nóng)藥的創(chuàng)制[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，(3)：102-104.

[2] 李勇，楊慧敏.微生物農(nóng)藥的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].貴州農(nóng)藥科學(xué)，2003，31(2)：62-63.

[3] 朱昌雄，宋淵.我國(guó)農(nóng)用抗生素的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)探討[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006，8(6)：17-19.

[4] Matsumoto M，Mogi Kin-ichi，Nagaoka Katsuhiko，et al. New piericidin glucosides，glucopiericidins A and B[J].The Journal of Antibiotics，1987，40(2)：149-156.

[5] Funayama Shinji, Ishibashi Masami, Anraku Yumi, et al.Novel cytocidal antibiotics，glucopiericidins A1 and A2. Taxonomy，fermentation，isolation，structure elucidation and biological characteristics[J].The Journal of Antibiotics，1989，42(12)：1734-1740.