潮間帶產(chǎn)絮凝劑放線(xiàn)菌的篩選及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

耿 強(qiáng)，馮勝科，張 超，劉其友

(1.中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266555；2.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300073；3.中國(guó)石化石油化工科學(xué)研究院，北京 100083)

微生物絮凝劑是一類(lèi)可以使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物，是高效、廉價(jià)、安全、無(wú)毒、易降解、不產(chǎn)生二次污染的新型水處理劑[1]。

目前，產(chǎn)絮凝劑微生物的種類(lèi)很多，主要集中在土壤中的細(xì)菌，專(zhuān)門(mén)研究潮間帶產(chǎn)絮凝劑放線(xiàn)菌的報(bào)道較少。作者在此系統(tǒng)地對(duì)潮間帶具有較好絮凝效果的放線(xiàn)菌進(jìn)行篩選，得到了一株絮凝活性較高的菌株Y-3，優(yōu)化了其培養(yǎng)條件并考察了其對(duì)含油廢水的處理效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種來(lái)源于青島開(kāi)發(fā)區(qū)唐島灣潮間帶底泥。

分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，KCrO40.1 g，海水1000 mL，pH值7.4～7.6。

篩選與發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCrO40.1 g，海水 1000 mL，pH值7.4～7.6。

保藏培養(yǎng)基：高氏斜面培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選及鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，確定絮凝效果較好的菌株。采用Nikon TS100型相差生物顯微鏡及成像系統(tǒng)對(duì)篩選菌株的形態(tài)、特征進(jìn)行觀察，并通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)[2]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察培養(yǎng)基組成及初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝效果的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定培養(yǎng)基以乙醇作為碳源、酵母膏作為氮源，選取4個(gè)主要因素即初始pH值、培養(yǎng)溫度、乙醇用量、搖床轉(zhuǎn)速作為放線(xiàn)菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的影響因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[3]，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.2.3 含油廢水絮凝實(shí)驗(yàn)

在500 mL燒杯中加入300 mL含油廢水，用移液槍移取少量微生物絮凝劑，將燒杯置于電子變速攪拌機(jī)攪拌棒下，先快速(200 r·min-1)攪拌2 min，再慢速(60 r·min-1)攪拌6 min，然后靜置10 min。之后從燒杯同一高度取50 mL上清液，測(cè)定含油廢水的濁度、石油類(lèi)和COD去除率。其中COD、濁度、石油類(lèi)的測(cè)定分別采用重鉻酸鉀法、分光光度法和紫外分光光度法[4]。

1.2.4 絮凝率測(cè)定方法

采用高嶺土法[5]測(cè)定絮凝效果，并加以修正。向250 mL燒杯中加入150 mL 4 g·L-1高嶺土懸浮液、3 mL微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)液，放置在六聯(lián)攪拌機(jī)下，插入攪拌葉輪。先快速(200 r·min-1)攪拌1 min，再慢速(60 r·min-1)攪拌3 min，然后靜置5 min。取上清液，用721型分光光度計(jì)測(cè)定其OD550。同時(shí)以蒸餾水代替培養(yǎng)液作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。絮凝率按下式計(jì)算：

式中：A為對(duì)照上清液吸光度值；B為樣品上清液吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離與初篩

用高氏一號(hào)培養(yǎng)基對(duì)唐島灣潮間帶3處底泥樣進(jìn)行分離，結(jié)果顯示高氏一號(hào)培養(yǎng)基上沒(méi)有或很少菌落形成，說(shuō)明高氏培養(yǎng)基缺乏海水中的某些微量元素，不適合潮間帶底泥中放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)。將去離子水改換為海水后共分離出18株放線(xiàn)菌，所測(cè)絮凝率如表2所示。菌株絮凝效果分布見(jiàn)圖1。

表2 初篩絮凝活性測(cè)定值/%

圖1 放線(xiàn)菌絮凝效果分布圖

由表2和圖1可知，大部分放線(xiàn)菌具有一定絮凝活性，同時(shí)出現(xiàn)了絮凝率為負(fù)值的菌株，可能是由于放線(xiàn)菌自身在培養(yǎng)基中的代謝物質(zhì)的影響。對(duì)高嶺土具有較高絮凝活性(絮凝率>80%)的放線(xiàn)菌菌株共有3株，占16.67%，對(duì)其進(jìn)行含油廢水復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 菌株的復(fù)篩

對(duì)初篩得到的3#、4#、10#菌株進(jìn)行含油廢水的絮凝實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)篩菌株對(duì)含油污水的絮凝效果/%

由表3可知，3#菌株不僅對(duì)高嶺土具有很高的絮凝活性，對(duì)含油廢水絮凝效果也最好，將其命名為Y-3，進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。

2.1.3 菌株的鑒定

對(duì)復(fù)篩得到的Y-3菌株進(jìn)行顯微鏡菌落特征檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 Y-3菌株的個(gè)體與菌落形態(tài)

由圖2可知，菌株個(gè)體為細(xì)桿狀，無(wú)鞭毛，菌落呈圓形，氣生菌絲為乳白色，基質(zhì)菌絲為象牙黃，表面粗糙有褶皺呈絨毛狀，邊緣整齊，中間突起。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株能利用蔗糖、葡萄糖但不能利用果糖，能使淀粉水解而不能使纖維素水解，能使牛奶凝固、明膠液化，這些特征基本符合放線(xiàn)菌鏈霉菌屬[6]。因此，初步鑒定菌株Y-3為鏈霉菌屬。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基組成對(duì)絮凝效果的影響(表4)

表4 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化/%

由表4可知，乙醇為碳源、酵母膏為氮源，放線(xiàn)菌產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果較好。乙醇作為碳源，價(jià)格低廉并且具有滅菌作用，因此有利于工業(yè)應(yīng)用。酵母膏為天然有機(jī)質(zhì)，富含氮源以外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利于代謝產(chǎn)物形成，產(chǎn)生的絮體較大。高鹽度的培養(yǎng)基會(huì)降低放線(xiàn)菌的數(shù)量，抑制放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)[7]。因此，培養(yǎng)基宜選擇低鹽度。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝效果的影響(圖3)

圖3 初始pH值對(duì)絮凝效果的影響

由圖3可知，在酸性條件下，pH值對(duì)絮凝效果的影響不大；當(dāng)培養(yǎng)基偏中性(pH=6.0～7.5)時(shí)，絮凝效果最好；而在堿性條件下，絮凝率迅速下降，說(shuō)明該放線(xiàn)菌所產(chǎn)絮凝劑為陰離子型[4]。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝效果的影響(圖4)

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)放線(xiàn)菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的影響

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝效果的影響(圖5)

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝效果的影響

由圖5可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)，菌株Y-3所產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果最好。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表5)

表5 放線(xiàn)菌產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表5可知，各因素對(duì)絮凝效果的影響大小依次為：培養(yǎng)溫度>初始pH值>乙醇用量>搖床轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)溫度對(duì)放線(xiàn)菌產(chǎn)絮凝劑的絮凝率影響最大。

綜合考慮，確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B2C3D1，即培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH值7.0、乙醇用量35 mL·(L海水)-1、搖床轉(zhuǎn)速130 r·min-1，在此條件下，放線(xiàn)菌Y-3對(duì)高嶺土的絮凝率達(dá)到92.76%。

2.4 絮凝劑對(duì)含油廢水的絮凝效果

考察在最優(yōu)培養(yǎng)條件下放線(xiàn)菌Y-3所產(chǎn)絮凝劑對(duì)含油廢水的處理效果。結(jié)果表明，濁度去除率為66.4%，COD去除率為19.23%，石油類(lèi)去除率為23.64%，效果較好。

3 結(jié)論

(1)從潮間帶底泥中篩選得到絮凝活性較高的菌株Y-3，優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：乙醇為碳源，酵母膏為氮源，低鹽度；培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH值7.0，乙醇用量35 mL·(L海水)-1，搖床轉(zhuǎn)速130 r·min-1。在此條件下，對(duì)高嶺土的絮凝率達(dá)到92.76%。

(2)放線(xiàn)菌Y-3對(duì)含油廢水具有較好的絮凝效果和一定的降解作用，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，所產(chǎn)絮凝劑對(duì)含油廢水的濁度去除率達(dá)到66.4%、COD去除率達(dá)到19.23%、石油類(lèi)去除率達(dá)到23.64%，具有一定工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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