高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定豨薟草中豨薟苷和奇壬醇

許鳳清， 劉金旗， 王舉濤， 黃金萍， 張 娟

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院/安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230038)

豨薟草為常用中藥，始載于唐代《新修本草》，《中國(guó)藥典》2010年版收載菊科植物豨薟Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨薟Siegesbeckia pubescens Makino.和毛梗豨薟Siegesbeckia glabrescens Makino.的地上干燥部分，具有祛風(fēng)濕，利筋骨的功能。臨床上主要用于風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、四肢麻痹、半身不遂、風(fēng)疹濕瘡等癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)豨薟草在心血管系統(tǒng)、抗炎、降壓擴(kuò)張血管、微循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及抗早孕方面均顯示良好的活性［1-7］。其主要成分為二萜類化合物，包括豨薟苷、奇壬醇、豨薟苷元、豨薟萜內(nèi)酯等［8］，總萜類成分定量測(cè)定采用紫外分光光度法［9］。目前，奇壬醇作為其定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［10］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC法檢測(cè)豨薟草中另一主要活性物質(zhì)豨薟苷來(lái)完善豨薟草的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津LC-20AT);SPD-20A紫外檢測(cè)器;N2010色譜工作站;AS3120型超聲清洗器(Autoscience公司);CP2115D電子天平(Sartorius公司)。

1.2 試藥 豨薟苷對(duì)照品(由安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥化教研室［11］自制);奇壬醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所111726-200601);乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。豨薟草分別收集和采購(gòu)于安徽省各不同中藥材產(chǎn)地，由安徽中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室劉守金教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液(24∶6∶70);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm;進(jìn)樣量:20 μL。該色譜條件下豨薟苷、奇壬醇達(dá)到基線分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和亳州飲片廠豨薟草(B)HLPC圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取豨薟苷、奇壬醇對(duì)照品1.68 mg、2.66 mg，分別置于 10 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取5.0 mL對(duì)照品溶液，置10 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液。豨薟苷質(zhì)量濃度為84 μg/mL，奇壬醇質(zhì)量濃度為 133 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備［12］精密稱取豨薟草粉末1 g，置索氏提取器，加沸程60～90℃的石油醚浸泡過(guò)夜，連續(xù)回流5 h，冷卻，取出濾紙筒，揮盡石油醚，轉(zhuǎn)移到100 mL的燒瓶，精密加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量，加熱回流2 h，放置至室溫，再次稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品試液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密移取豨薟苷和奇壬醇混合對(duì)照品貯備液 1、2、4、8、10、20 μL，按 2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得豨薟苷回歸方程為 Y=843867X －34778，r=0.9998，在 0.084 ～1.68 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;奇壬醇回歸方程為 Y=1615648X+8592，r=0.9999，在 0.133 ～2.66 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下方法制備的供試品溶液(亳州飲片廠)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)定豨薟苷、奇壬醇，RSD值分別為1.20%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察 取豨薟草樣品(亳州飲片廠)供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，按上述條件測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定豨薟苷、奇壬醇，RSD分別為 1.52%、1.64%，說(shuō)明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取豨薟草樣品(亳州飲片廠)，精密稱定6份，置索氏提取器中，按照2.3項(xiàng)下操作，測(cè)定豨薟苷、奇壬醇，RSD值分別為1.82%、2.03%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知豨薟苷和奇壬醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(分別為 0.357%、0.053%)的亳州飲片廠豨薟草 0.5 g，精密稱定。按照2.3項(xiàng)下方法脫脂后，每3份為1組分別加入80%、100%、120%量的豨薟苷和奇壬醇對(duì)照品后，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算豨薟苷、奇壬醇的平均回收率和 RSD分別為98.44%，2.27%和 100.58%，2.42%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 豨薟苷、奇壬醇加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.9 樣品測(cè)定 按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)，并記錄豨薟苷和奇壬醇峰面積，經(jīng)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 在樣品處理的過(guò)程中，程志宏等［12］曾采用石油醚脫脂法處理豨薟草葉片中大量葉綠素，取得較好的效果;豨薟苷分離工作中發(fā)現(xiàn)豨薟草中富含大量的鹽，且豨薟苷在甲醇中的溶解度不佳，本實(shí)驗(yàn)采用的樣品處理方法達(dá)到HPLC樣品處理要求。同時(shí)考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸鹽，乙腈-磷酸鹽溶液等流動(dòng)相，最終確定乙腈-甲醇-0.05 mol/L KH2PO4(24∶6 ∶70)，體積流量為1.0 mL/min，分離效果良好，豨薟苷、奇壬醇分別在17 min、24 min左右出峰，分析快速準(zhǔn)確，重復(fù)性好，回收率高，是測(cè)定豨薟草中有效成分的理想方法。

表2 豨薟草中豨薟苷、奇壬醇的測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3.2 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，安徽省各產(chǎn)地豨薟草中豨薟苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.017% ～0.379%之間，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%，奇壬醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.009% ～0.141%之間，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.067%，不同種類豨薟草中豨薟苷、奇壬醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化并無(wú)規(guī)律;不同產(chǎn)地豨薟草中二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差也較大且不成比例關(guān)系。

3.3 豨薟苷是豨薟草中有效成分之一，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，以葡萄糖苷的形式存在于豨薟草植物體中，通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)豨薟苷僅為豨薟草所獨(dú)有，專屬性強(qiáng)。因此，建議在豨薟草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加豨薟苷并結(jié)合奇壬醇共同控制豨薟草的質(zhì)量。

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