應(yīng)用ASE－LC－ESI－MS法快速篩選腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分

羅永東，林培玲，吳水生，梁一池

（福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350108）

腫節(jié)風(fēng)（Sarcandrae herba）為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全草，性苦、辛、平，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血、活血消斑、袪風(fēng)通絡(luò)的功效，可用于血熱發(fā)斑發(fā)疹，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，腫節(jié)風(fēng)具有抗腫瘤、廣譜抗菌、提高免疫、抗疲勞、延長壽命、抗寒、治療胃潰瘍、鎮(zhèn)痛和促進(jìn)骨折愈合等藥理作用［2］，臨床應(yīng)用廣泛。腫節(jié)風(fēng)藥材含有多種化學(xué)成分，主要類型有有機(jī)酸、揮發(fā)油、倍半萜、黃酮苷及香豆素類化合物等［3］，但其功效成分并不明確。綜合運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、系統(tǒng)聚類和主成分分析等模式識(shí)別技術(shù)對腫節(jié)風(fēng)藥材進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究［4］，提供了一種全面、準(zhǔn)確和快速的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，但液相色譜法在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品對照的條件下難以對色譜峰提供準(zhǔn)確的信息，其共有峰的選擇，有一定的隨意性，不一定能反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通過對各組分峰紫外吸收光譜和質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子分析，能快速鑒定化學(xué)成分，對全面了解藥材中各化學(xué)成分的存在情況具有獨(dú)特優(yōu)勢。因此，為更為合理地進(jìn)行腫節(jié)風(fēng)藥材的指紋圖譜研究，以及后續(xù)的腫節(jié)風(fēng)譜效關(guān)系研究，本文建立了一種快速的ASE－LC－PADESI－MS分析方法定性分析腫節(jié)風(fēng)藥材的化學(xué)成分。

1 儀器與試劑

Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀（美國，Waters公司），配有ESI（電噴霧電離）離子源，Masslynx 4.02工作站；one PSE快速壓力溶劑萃取儀（美國，Applied Separations，Inc）；Milli－Q純水機(jī)（美國，Millipore 公 司 ），SartoriusBP211D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國，MERCK公司）。

反丁烯二酸對照品（fumaric acid，分子式：C4H4O4分子量：116.07；批號(hào)：1541－20001），購自中國藥品生物制品檢定所；異嗪皮啶對照品（isofraxidin，分子式：C11H10O5分子量：222.19；批號(hào)：071011）和迷迭香酸對照品（rosmarinic acid，分子式：C18H16O8，分子量：360.33；批號(hào)：100209）均購自上海宏達(dá)商貿(mào)有限公司；4－羥基－3－甲氧基苯甲酸（vanillic acid，分子式：C8H8O4分子量：168.19）、4－羥基－3，5－二甲氧基苯甲酸（syringic acid，分子式：C9H10O5，分子量：198.18）、3，4－二羥基苯甲酸（3，4－dihydroxybenzonic acid，分子式：C7H6O4分子量：154.12）、綠原酸（Chlorogenic acid，分子式：C16H18O9分子量：354.3087）、咖啡酸（Cafferic acid，分子式：C9H7O4，分子量：179.15）和依斯坦布林 A（istanbulin A，分子式：C15H20O4，分子量：264.32）為江西中醫(yī)學(xué)院羅永明教授友情贈(zèng)予，純度經(jīng)HPLC（面積歸一法）檢測大于98.0%。腫節(jié)風(fēng)藥材于2011年3月份采于福建三明吉口采育場，經(jīng)梁一池教授鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai的干燥全草。

2 方法

2.1 PSE萃取方法制備樣品

腫節(jié)風(fēng)藥材適當(dāng)粉碎，取粗粉4.0g（不小于20目），置于one PSE快速壓力溶劑萃取儀萃取釜中，萃取釜底部提前加入過濾膜，將萃取釜放在萃取釜固定裝置上，關(guān)閉萃取釜門。選擇30%乙醇作為提取溶劑，設(shè)定PSE萃取方法參數(shù)（預(yù)熱平衡時(shí)間5min，靜態(tài)萃取溫度100℃，壓力56bar，靜態(tài)萃取時(shí)間10min，沖洗體積60%萃取釜體積，提取次數(shù)1次，載氣吹脫時(shí)間100s）。啟動(dòng)one PSE快速壓力溶劑萃取儀，提取完成后自動(dòng)停止。所得萃取液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加30%乙醇定容，即得供試品。進(jìn)樣前過0.22μm濾膜。

2.2 色譜條件

Waters XTerra MS C18色譜柱（2.1mm×150mm，5μm），柱溫40℃，流速0.3mL／min，流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫程序：A：0～25min，15%；25～30min，15%～45%；30～50min，45%；50～55min，45%～100%；55～69min，100%。進(jìn)樣量5μL，全波長掃描。

2.3 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI）。正離子模式：毛細(xì)管電壓，2.97kV；錐孔電壓70.00V。負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓，2.50kV；錐孔電壓50.00V。其它二級(jí)錐孔電壓3.00V，六級(jí)桿透鏡電壓0.3V，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度200℃，錐孔氣的流量50L／Hr，脫溶劑氣流量350L／Hr，選擇質(zhì)核比范圍（Mass range）：100～1500m／z。數(shù)據(jù)由Masslynx 4.00（Waters公司）獲得和處理。

3 結(jié)果和討論

圖1為樣品正負(fù)離子模式下全掃描圖。提取離子流（EIC）：［M＋H］＋，［M＋Na］＋，［2M＋Na］＋，［M－H］－，［M＋HCOO］－，［2M－H］－等特征準(zhǔn)分子離子峰，同時(shí)根據(jù)化合物液相色譜行為，推斷出22種化合物的分子量。并通過與對照品的質(zhì)譜行為對照和相關(guān)文獻(xiàn)分析［5－7］，鑒定了腫節(jié)風(fēng)藥材9個(gè)主要化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

表1 腫節(jié)風(fēng)藥材各色譜峰分析

圖1 樣品的總離子流（TIC）

PSE（Pressurized solvent EXtraction）提取方法為快速溶劑萃取ASE（Accelerated Solvent Extraction）的一種?？焖偃軇┹腿。ˋSE，Accelerated Solvent Extraction）是一種在較高的溫度（50℃～150℃）和壓力（60～130bar）下用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎樣品前處理方法，具有萃取時(shí)間短、溶劑用量少、提取率高、溶劑回收率高、所得產(chǎn)品品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，在它推出的很短時(shí)間內(nèi)就被美國國家環(huán)保局批準(zhǔn)為EPA3545號(hào)標(biāo)準(zhǔn)方法［8］。因one PSE快速壓力溶劑萃取儀自身帶有壓力過濾功能，本實(shí)驗(yàn)所制得樣品非常干凈，無常用的超聲萃取方法所得萃取物放置一段時(shí)間后產(chǎn)生的沉淀物，對色譜柱影響小。同時(shí)，機(jī)器操作所帶來的實(shí)驗(yàn)誤差小，重現(xiàn)性好。

本文建立了一種快速溶劑萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對腫節(jié)風(fēng)藥材化學(xué)成分進(jìn)行快速分析的方法。通過對照品和相關(guān)文獻(xiàn)分析，準(zhǔn)確地鑒定了腫節(jié)風(fēng)藥材所含的9種化學(xué)成分，為腫節(jié)風(fēng)藥材的化學(xué)成分的快速篩選提供了一種方法。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：208－209.

［2］張園，呂圭源，俞靜靜.腫節(jié)風(fēng)研究進(jìn)展［J］.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，38（5）：360－362.

［3］付菊琴，曲瑋，梁敬鈺.草珊瑚屬植物的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（1）：1－6.

［4］陳根順，徐麗芳，李鵬.草珊瑚的HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2009，42（2）：293－296.

［5］曾愛華，羅永明.草珊瑚化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2005，28（4）：292－293.

［6］朱麗萍，李媛，楊敬芝，等.草珊瑚的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2009，33（2）：155－157.

［7］段營輝，戴毅，高昊，等.草珊瑚的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2005，41（1）：29－32.

［8］劉 靜.ASE快速溶劑萃取——解決固體、半固體樣品前處理的新技術(shù)［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2002，3（7）：59－61.