神經(jīng)束植入治療家兔腓腸肌失神經(jīng)支配的療效評(píng)價(jià)

楊延軍， 邱偉婷， 黃 剛， 陳 飛， 馬立峰， 張子清

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院， 廣東 深圳 518116)

周?chē)窠?jīng)損傷在臨床上極為常見(jiàn)。盡管周?chē)窠?jīng)修復(fù)技術(shù)已有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但即使是新鮮、清潔的周?chē)窠?jīng)斷裂傷，及時(shí)采用先進(jìn)的顯微外科技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，通常也不可能獲得完全再生，功能也往往不能完全恢復(fù);而長(zhǎng)時(shí)間的感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)的缺失將引起肌肉萎縮、關(guān)節(jié)攣縮畸形等［1］。因此，如何促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷的再生，最大限度地恢復(fù)其功能，一直是神經(jīng)修復(fù)的基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。其中神經(jīng)修復(fù)的顯微外科手術(shù)包括：神經(jīng)松解術(shù)、神經(jīng)縫合術(shù)、神經(jīng)移植術(shù)、神經(jīng)移位術(shù)和神經(jīng)束植入骨骼肌術(shù)等［1，2］。本研究擬對(duì)家兔失神經(jīng)支配腓腸肌神經(jīng)束植入后其肌濕質(zhì)量、肌肉收縮能力的變化以及乙酰膽堿酯酶含量的變化進(jìn)行連續(xù)觀察，為臨床尋找檢測(cè)肌肉萎縮程度方法和評(píng)價(jià)神經(jīng)束植入術(shù)的療效。

1 材料與方法

1.1 失神經(jīng)支配腓腸肌神經(jīng)束植入動(dòng)物模型的制作：家兔48只(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重2.5 0.5kg/只，不拘雌雄，隨機(jī)分為3組，神經(jīng)植入組、神經(jīng)吻合組及對(duì)照組，每組16只。動(dòng)物麻醉后，在放大10倍手術(shù)顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組于右側(cè)梨狀肌下緣尋找坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)尋找其脛神經(jīng)分支，將其進(jìn)入腓腸肌的分支干進(jìn)入肌肉表面切斷，然后將按神經(jīng)束神經(jīng)干分割成數(shù)支。神經(jīng)植入組用10－0號(hào)顯微縫合線(xiàn)根據(jù)肌內(nèi)神經(jīng)的分布情況選擇性植入分別植入腓腸肌肌肉組織內(nèi);神經(jīng)吻合組對(duì)坐骨神經(jīng)發(fā)出支配腓腸肌分支后約1cm切斷，用10－0號(hào)顯微縫合線(xiàn)進(jìn)行端－端吻合;對(duì)照組則于神經(jīng)切斷后并切除進(jìn)入腓腸肌分支1－2mm，阻止神經(jīng)的自然生長(zhǎng)。分別于術(shù)后 2、4、6、8、12、16、20 及 24周處死取兩組右小腿腓腸肌作實(shí)驗(yàn)觀察。

1.2 肌肉濕重測(cè)定：將各時(shí)期處死家兔自股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)至跟骨結(jié)節(jié)止點(diǎn)完整取下腓腸肌，20℃用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)其體重。

1.3 肌肉收縮功能的測(cè)定：家兔麻醉后，固定、游離右側(cè)腓腸肌，保留血供，切斷腓腸肌遠(yuǎn)端肌腿并用絲線(xiàn)將肌腿直接與肌肉張力換能器水平相連，肌肉周?chē)粩嗟巫?7℃溫鹽水，局部烤燈保濕，用特制細(xì)銅絲雙極電極距入肌點(diǎn)2mm處直接刺激支配神經(jīng)，刺激頻率為1Hz和40Hz，波寬20ms，作張力－長(zhǎng)度曲線(xiàn)，記錄到最合適收縮長(zhǎng)度后，分別記錄肌肉單收縮力和最大強(qiáng)直收縮力。

1.4 乙酰膽堿酯酶染色觀察：將各時(shí)期動(dòng)物取材標(biāo)本解剖顯微鏡下分離出肌束，行膽堿酯酶染色4℃下60min(染色孵育液配制：0.1moL順丁烯二酸溶液(pH6.0)6.5mL內(nèi)依次加入碘化乙酰硫代膽堿5mg，0.1moL枸櫞酸鈉溶液0.5mL，20nmoL硫酸銅溶液1.5mL，蒸餾水2mL，5nmoL鐵氰化鉀溶液1mL，蔗糖1g)染色后直接壓片光學(xué)顯微鏡下觀察，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，對(duì)各組取材乙酰膽堿酯酶含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取3張切片，400倍光鏡下隨機(jī)選取20個(gè)運(yùn)動(dòng)終板，檢測(cè)乙酰膽堿酯酶染色的縱斷面光鏡切片酶的灰度值(酶含量的灰度值為實(shí)際含量的倒數(shù)，數(shù)值越小，含量越高)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌濕質(zhì)量結(jié)果見(jiàn)表1，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)植入組間肌濕質(zhì)量逐漸增加，神經(jīng)吻合組肌濕質(zhì)量呈緩慢上升趨勢(shì)。對(duì)照組肌濕質(zhì)量呈緩慢下降趨勢(shì)。神經(jīng)植入組在第12周時(shí)肌濕質(zhì)量開(kāi)始大于神經(jīng)吻合組(P＞0.05)。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間單肌收縮力的變化見(jiàn)表2，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)植入組單肌收縮力逐漸增加，到16周時(shí)，神經(jīng)植入組與對(duì)照組單肌收縮力已經(jīng)沒(méi)有差別。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌肉收縮力的變化見(jiàn)表3，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)植入組單肌收縮力明顯增加。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間乙酰膽堿酯酶含量的變化見(jiàn)表4，在16周前，膽堿酯酶含量的變化不是很明顯，16周后，植入組膽堿酯酶含量明顯增加。

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌濕質(zhì)量變化分析(s，n=16)

表1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌濕質(zhì)量變化分析(s，n=16)

注：與對(duì)照組相比，＊＊P ＜0.01，＊P ＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，##P ＜0.01，#P ＜0.05

組別時(shí)間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 1.275 0.064＊ 1.280 0.057＊ 1.280 0.042＊ 1.303 0.023＊ 1.335 0.007＊#1.405 0.007＊＊#1.515 0.035＊＊#1.770 0.014＊＊##神經(jīng)吻合組 1.180 0.050 1.165 0.064 1.180 0.071 1.220 0.028 1.220 0.014＊ 1.230 0.014＊＊ 1.240 0.141 1.310 0.014＊對(duì)照組 0.975 0.035 0.940 0.014 0.925 0.007 0.915 0.007 0.905 0.007 0.895 0.007 0.895 0.021 0.8800.014

表2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

表2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

注：與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時(shí)間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 44.5 0.7# 51.0 1.4# 54.5 0.7＊# 61.0 1.4＊# 65.5 0.7＊＊# 71.0 1.7＊＊ 71.0 3.4＊＊ 79.0 1.4＊＊神經(jīng)吻合組 67.5 0.7＊ 70.0 2.8＊ 72.5 1.7＊＊ 74.0 1.4＊＊ 75.5 2.7＊＊ 75.5 3.7＊＊ 75.5 1.7＊＊ 75.5 0.7＊＊對(duì)照組 41.5 2.1 46.5 0.7 48.5 0.7 50.5 0.7 47.5 0.7 45.5 0.7 45.5 0.7 44.70.6

3 討論

周?chē)窠?jīng)損傷后骨骼肌萎縮及運(yùn)動(dòng)終板退變的防治一直是周?chē)窠?jīng)外科研究領(lǐng)域的難題。骨骼肌及運(yùn)動(dòng)終板的狀態(tài)決定著神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。

Sunderland［3］發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)維持需靠一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用，失神經(jīng)支配后最大變化是這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子丟失導(dǎo)致的肌肉形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化及新陳代謝等方面改變。而失神經(jīng)支配肌肉在形態(tài)學(xué)上首先表現(xiàn)為肌細(xì)胞漿丟失及直徑減少。骨骼肌失神經(jīng)支配后組織形態(tài)學(xué)改變：周?chē)窠?jīng)損傷后，骨骼肌因失去神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及廢用而發(fā)生萎縮。隨著失神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種萎縮會(huì)逐漸加重，其質(zhì)量也會(huì)較前逐漸減輕，腓腸肌肌濕質(zhì)量恢復(fù)率的高低取決于該肌重獲坐骨神經(jīng)再生纖維支配的間隔時(shí)間的長(zhǎng)短和能與其運(yùn)動(dòng)終板有效連接的再生神經(jīng)纖維的多少，所以腓腸肌(濕質(zhì)量)恢復(fù)率可作為衡量坐骨神經(jīng)再生效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在本研究中，神經(jīng)植入組腓腸肌肌濕質(zhì)量在手術(shù)后第2周就明顯重于對(duì)照組(P＜0.05)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)植入組腓腸肌肌濕質(zhì)量增重明顯，這種差異愈發(fā)明顯。神經(jīng)吻合組肌濕質(zhì)量呈緩慢上升趨勢(shì)，在12周時(shí)，與神經(jīng)植入組比較，差異開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，神經(jīng)植入組重于吻合組(P＜0.05)。從而表明神經(jīng)植入對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)及神經(jīng)再生的效果優(yōu)于神經(jīng)吻合。而對(duì)照組因失神經(jīng)支配后，骨骼肌因失去神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及費(fèi)用而發(fā)生萎縮，所以質(zhì)量較前逐漸減輕。

神經(jīng)植入組與吻合組肌肉單肌收縮力與強(qiáng)直收縮力在術(shù)后均不斷增強(qiáng)，但植入組增加更快，這說(shuō)明神經(jīng)植入能明顯改善肌肉的收縮性能。

在正常生理狀態(tài)下，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元通過(guò)運(yùn)動(dòng)終板與骨骼肌纖維建立聯(lián)系，支配骨骼肌完成各種生理功能。神經(jīng)損傷后，近端軸突逆行潰編，神經(jīng)元受損乃至死亡;遠(yuǎn)端軸突及運(yùn)動(dòng)終板發(fā)生變形改變。骨骼肌纖維也因失去了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)而發(fā)生變形以及酶活性和分布的改變。遠(yuǎn)端軸突發(fā)生waller變形，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶活性下降。

神經(jīng)再生時(shí)，運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶活性恢復(fù)正常。乙酰膽堿酯酶主要來(lái)源于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體，通過(guò)軸突快速運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)終末，乙酰膽堿酯酶活性的強(qiáng)弱反映運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能狀態(tài)［4］。終板區(qū)乙酰膽堿酯酶含量多少亦可能反映終板退變及再生情況［5］。在本研究中，神經(jīng)植入組及吻合組乙酰膽堿酯酶均呈上升趨勢(shì)，在第20周時(shí)，植入組乙酰膽堿酯酶含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。而對(duì)照乙酰膽堿酯酶含量變化不明顯。乙酰膽堿酯酶對(duì)乙酰膽堿有特異性水解作用，主要分布于運(yùn)動(dòng)終板處的突觸前膜及后膜，神經(jīng)發(fā)放的沖動(dòng)通過(guò)運(yùn)動(dòng)終板將乙酰膽堿傳遞給肌肉，從而引起肌肉收縮。終板區(qū)乙酰膽堿酯酶含量的多少能夠反映出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)終板退變和再生的情況［6］。本實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)植入組在術(shù)后16周前，膽堿酯酶含量沒(méi)有明顯變化，16周后明顯升高，Hu等認(rèn)為運(yùn)動(dòng)終板和膠原纖維的消失是影響去神經(jīng)支配晚期療效的主要因素，從而表明神經(jīng)植入晚期療效明顯。

表3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌肉強(qiáng)直收縮力的變化(s，n=16)

表3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間肌肉強(qiáng)直收縮力的變化(s，n=16)

注：與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時(shí)間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 241.5 2.12#＊＊ 252.2 1.45#＊＊ 270.5 2.76＊＊#341.0 1.45＊＊＊#445.5 10.7＊＊ 471.0 11.4＊＊ 481.0 12.6＊＊ 479.0 16.4＊＊神經(jīng)吻合組 427.0 31.11＊＊ 429.0 12.87＊＊ 432.5 12.77＊＊ 434.0 1.4＊＊ 455.5 0.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 478.5 20.7＊＊對(duì)照組 150.5 7.77 146.5 6.74 148.5 7.78 146.5 6.74 137.5 6.32 135.5 8.76 125.5 8.77 124.69.65

表4 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

表4 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

所測(cè)數(shù)據(jù)為酶含量的灰度值－實(shí)際含量的倒數(shù)，數(shù)值越小，含量越高注：與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經(jīng)植入組與神經(jīng)吻合組相比，#P ＜0.05

組別時(shí)間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經(jīng)植入組 121.5 12.12 122.2 11.45 130.5 12.76 141.0 11.45 145.5 10.7 171.0 11.4＊ 281.0 12.6＊＊#289.0 16.4＊＊#神經(jīng)吻合組 127.0 31.11 129.0 12.87＊＊ 132.5 12.77＊＊ 134.0 11.4 155.5 20.7 175.5 30.7＊ 175.5 20.7＊ 178.5 10.7＊對(duì)照組 120.5 17.77 126.5 16.74 128.5 17.78 146.5 6.74 137.5 16.32 135.5 18.76 125.5 18.76 129.619.65

［1］Siemionow，M.and A.Sari.A contemporary overview of peripheral nerve research from the Cleveland clinic microsurgery laboratory［J］.Neurol Res，2004，26(2)：218 －225.

［2］Myckatyn，T.M.and S.E.Mackinnon.A review of research endeavors to optimize peripheral nerve reconstruction［J］.Neurol Res，2004.26(2)：124 －138.

［3］Sunderland S.Factors influencing the development and se-verity of the changes in denervated muscle.In：Nerve injury and repair［M］.Churchill living － stone，London，1991.247－257.

［4］殷琦，陸裕樸，褚曉朝，等.晚期周?chē)窠?jīng)損傷治療臨床及實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華骨科雜志，1995，15(9)：596 －599.

［5］許小珊，沈菊英.運(yùn)動(dòng)終板及其神經(jīng)末梢的染色方法［J］.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1980，9：105.

［6］殷琪，陸裕樸，胡蘊(yùn)玉，等.肌肉失神經(jīng)支配后運(yùn)動(dòng)終板早晚期退變實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，1995，9(1)：16 －8.