PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究

張 棟 孔德璇 和珍珍 瞿全新

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路是一個經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及放化療抵抗中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt通路異常與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，PI3K抑制劑聯(lián)合傳統(tǒng)化學(xué)療法可能是一種有效抑制腫瘤生長和腹水產(chǎn)生的方法[1]。腫瘤細(xì)胞對順鉑（DDP）的獲得性和先天性的耐藥是DDP類化療藥抗腫瘤的一個最大障礙[2]。本研究利用LY294002抑制PI3K/Akt通路，探討PI3K/Akt通路在卵巢癌DDP耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞系：人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞順鉑敏感株SKOV3，由天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)實驗室提供；人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞DDP耐藥株SKOV3/DDP，購自北京市腫瘤醫(yī)院藥物研究所。（2）儀器與試劑：一抗（PI3K兔抗人單克隆抗體、Akt兔抗人單克隆抗體）購自長沙嘉美生物公司；一抗（β-actin兔多克隆抗體）購自美國Santa Cruz公司；二抗（HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，LY294002購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 S KOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞于37℃、5%CO2、含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞DDP半數(shù)抑制濃度值（IC50）實驗分組。（1）LY294002作用組：將2種細(xì)胞分別置于LY294002濃度為40 μmol/L的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL培養(yǎng)4 h后取出，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基180 μL。配制各濃度DDP，每孔加入20 μL DDP，使DDP終質(zhì)量濃度分別為 1 00.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56及0.78 mg/L，每一濃度設(shè)4個平行孔。同時設(shè)立對照孔（只含等體積細(xì)胞懸液，不加藥物）、空白調(diào)零孔（只含等體積完全培養(yǎng)基，不加藥物）培養(yǎng)72 h。（2）LY294002作用前組：調(diào)節(jié)2種細(xì)胞濃度為1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL，培養(yǎng)4 h后取出，加入各濃度DDP，方法同上，培養(yǎng)72 h。

檢測細(xì)胞PI3K/Akt蛋白表達(dá)實驗分組。（1）LY294002各濃度組：25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)2種細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%~80%匯合時，加入LY294002，配制成濃度為5、10、20及40 μmol/L，培養(yǎng)4 h后加入DDP，使DDP在SKOV3細(xì)胞中的終質(zhì)量濃度為3.5 mg/L，在SKOV3/DDP細(xì)胞中的終質(zhì)量濃度均為14.0 mg/L，分別接近其IC50。（2）DDP組：取DDP終質(zhì)量濃度為SKOV3細(xì)胞3.5 mg/L、SKOV3/DDP細(xì)胞14.0 mg/L。（3）對照組：正常培養(yǎng)條件下的SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞。以上細(xì)胞經(jīng)處理后均培養(yǎng)24 h。

1.2.2 MTT法檢測LY294002作用后SKOV3和SKOV3/DDP對DDP敏感性的影響 9 6孔細(xì)胞板每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩5 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值（A）。計算各組細(xì)胞的抑制率。實驗重復(fù)3遍，取平均值。細(xì)胞生長抑制率=（1-加藥組A值/對照組A值）×100%。根據(jù)各組DDP濃度和抑制率，計算兩者的回歸系數(shù)a、b，代入公式：Y=a+blnX，計算細(xì)胞DDP IC50值。耐藥倍數(shù)=（SKOV3/DDP細(xì)胞DDP IC50值）（/SKOV3細(xì)胞DDP IC50值）。

1.2.3 Western blot檢測SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞PI3K、Akt及β-actin表達(dá) 每 瓶細(xì)胞使用400 μL含苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白上樣量為20 μL ，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，1∶500比例加入一抗，孵育、洗膜，以1∶5 000加入二抗后孵育、洗膜、顯影。膠片經(jīng)Bio-Rad成像分析軟件Quantity One分析結(jié)果，將目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值之比作為目的蛋白相對濃度。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采 用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性 LY294002作用前后各濃度DDP對SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞生長抑制率，見表1。LY294002作用前：SKOV3細(xì)胞DDP的IC50（3.309 4±0.177 1）mg/L；SKOV3/DDP 細(xì) 胞 DDP 的 IC50為（13.630 7±0.934 2）mg/L，耐 藥 倍 數(shù) 為 4.12。LY294002作用后：SKOV3細(xì)胞DDP IC50為（1.080 2±0.062 1）mg/L，與LY294002作用前相比DDP IC50差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.57，P<0.001），SKOV3細(xì)胞經(jīng)LY294002作用后對DDP敏感性增加了67.36%；SKOV3/DDP細(xì)胞DDP的IC50為（3.194 9±0.194 1）mg/L，與LY294002作用前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.94，P<0.001），SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)LY294002作用后對DDP敏感性增加了76.56%。

表1 LY294002作用前后各濃度DDP對細(xì)胞生長的抑制作用 （%，±s）

表1 LY294002作用前后各濃度DDP對細(xì)胞生長的抑制作用 （%，±s）

0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 7.71±1.05 35.66±3.49 49.64±1.25 81.10±1.85 89.78±1.28 91.19±1.02 91.93±0.92 94.04±2.36 28.17±2.80 57.47±2.06 68.67±2.80 92.40±0.89 95.71±0.99 97.00±0.87 96.70±0.76 97.55±0.37 4.59±1.17 9.05±0.53 13.04±1.38 19.49±1.38 43.33±2.34 71.51±2.40 86.72±2.72 89.63±1.29 20.06±1.74 28.86±4.11 39.97±1.07 70.46±4.12 87.46±1.25 90.37±0.71 93.79±1.27 95.45±1.19 SKOV3細(xì)胞抑制率作用前 作用后 作用前 作用后SKOV3/DDP細(xì)胞抑制率DDP（mg/L）

2.2 LY294002、DDP對SKOV3細(xì)胞中PI3K、Akt表達(dá)的影響 PI3K蛋白在LY294002各濃度組的表達(dá)量不同，且進(jìn)一步組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001)；Akt蛋白在LY294002各濃度組的表達(dá)量不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001)，進(jìn)一步組間比較LY294002 5＋DDP組與DDP組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.488)，其他組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（組間比較①∶②、①∶⑥、②∶⑤、⑤∶⑥P分別為0.038、0.006、0.011、0.019，其余組間比較均P<0.001），見表2。

2.3 LY294002、DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞中 PI3K、Akt表達(dá)的影響 LY294002各組間PI3K蛋白的表達(dá)量不同，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（①∶②、⑤∶⑥P分別為0.005、0.004，其余組間比較均P<0.001）；各組間Akt蛋白表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001），見表3。

2.4 SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中PI3K和Akt表達(dá) SKOV3細(xì)胞對照組PI3K和Akt蛋白相對濃度值均低于SKOV3/DDP細(xì)胞對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為26.005和23.477，均P<0.05），見表2、3。

表2 SKOV3細(xì)胞中PI3K及Akt表達(dá)水平 （ ±s）

表2 SKOV3細(xì)胞中PI3K及Akt表達(dá)水平 （ ±s）

**P<0.01；表3同

Akt 1.211 4±0.026 6 1.139 5±0.034 7 0.898 7±0.063 2 0.592 2±0.025 3 1.233 3±0.025 0 1.303 5±0.046 9 150.510**PI3K 0.715 6±0.030 2 0.626 9±0.017 1 0.510 0±0.018 0 0.366 3±0.005 2 0.796 6±0.003 9 0.879 7±0.034 8 276.341**組別LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP⑤對照組⑥F

表3 SKOV3/DDP細(xì)胞中PI3K及Akt表達(dá)水平（±s）

表3 SKOV3/DDP細(xì)胞中PI3K及Akt表達(dá)水平（±s）

組別LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP組⑤對照組⑥F PI3K 1.313 1±0.012 5 1.226 2±0.010 9 1.046 4±0.019 0 0.808 8±0.029 4 1.553 5±0.058 4 1.446 9±0.014 7 236.437**Akt 1.735 7±0.013 4 1.579 7±0.018 5 1.372 7±0.039 5 1.030 0±0.009 5 2.143 2±0.002 9 1.974 3±0.015 8 1217.000**

3 討論

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過以下幾種途徑在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。（1）基因異常。PI3K CA的擴增、突變，PI3K CA基因編碼PI3K的P110 α亞基，位于染色體3q26，人類許多惡性腫瘤組織中可見到該染色區(qū)域的異常擴增，PI3K CA基因擴增與卵巢癌發(fā)生有關(guān)。Levine等[3]對198例晚期卵巢上皮癌組織中編碼P13K CA高度保守區(qū)域的EXON9和EXON20進(jìn)行基因測序，發(fā)現(xiàn)其中24例（12%）發(fā)生突變。在原發(fā)性卵巢癌中，PI3K調(diào)節(jié)亞單位p85α編碼基因的突變，導(dǎo)致ser608位點自動調(diào)節(jié)區(qū)域臨近位點與SH2之間的序列丟失，PI3K處于持續(xù)活化狀態(tài)，引起腫瘤發(fā)生。研究證實在一些卵巢癌組織中，Akt2基因發(fā)生擴增和過表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，并預(yù)示著預(yù)后不良[4]。（2）Akt表達(dá)異常。Noske等[5]發(fā)現(xiàn)58%原發(fā)性卵巢癌中存在Akt過表達(dá)，且與卵巢癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，運用RNA干擾降低Akt表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。

卵巢癌的耐藥機制目前還不完全清楚，研究表明，Akt能夠通過磷酸化其下游的多種作用底物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖；抑制細(xì)胞凋亡；提高細(xì)胞的缺氧耐受；促進(jìn)血管生成；促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移；促進(jìn)對化療和放療的抵抗[1]。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)下調(diào)Akt表達(dá)可輔助抗腫瘤治療。Peng等[7]發(fā)現(xiàn)Akt/mTOR通路的激活可以阻止DDP對卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用并且引起卵巢癌細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥。Fraser等[8]發(fā)現(xiàn)Akt可以通過抑制p53的磷酸化和細(xì)胞核功能導(dǎo)致人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生DDP耐藥。Weng等[9]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Akt2可以增加卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性,但目前對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多藥耐藥產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)關(guān)系的研究仍較少。

本研究結(jié)果表明，SKOV3/DDP細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白表達(dá)水平高于SKOV3細(xì)胞，以LY294002抑制PI3K/Akt蛋白表達(dá)可增強SKOV3細(xì)胞DDP敏感性，特別是在SKOV3/DDP細(xì)胞，對DDP敏感性達(dá)到其親本（SKOV3細(xì)胞）水平，提示PI3K/Akt信號通路異常與卵巢癌DDP耐藥有關(guān)，抑制PI3K/Akt信號通路能逆轉(zhuǎn)卵巢癌DDP耐藥表型。

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