Caspase 8和9在腫瘤局部微環(huán)境形成早期與調(diào)控蛋白Twist1的關(guān)聯(lián)性*

宗文康 孫保存 孫 濤 董學(xué)易 劉艷榮 古 強(qiáng) 趙秀蘭

線形程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種規(guī)律性的Caspases依賴性的腫瘤細(xì)胞群體死亡模式，其與血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）、內(nèi)皮依賴性血管（endothelium-dependent vessels，EV）的形成有關(guān)[1-2]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞失去上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞w移能力的間充質(zhì)表型的現(xiàn)象。EMT參與了VM的形成過程[3]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型，研究在LPPCN和VM形成中，Caspase 8、9對EMT調(diào)控蛋白Twist1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 C57BL6小鼠96只，6~8周齡，平均體質(zhì)量（21.0±1.9）g，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，清潔實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飲用水和飼料均由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Cas?pase 8抑制劑Z-IETD-FMK和Caspase 9抑制劑Z-LEHD-FM購自SIGMA公司，按照相應(yīng)劑量分別溶于0.1 mL含10%DMSO的生理鹽水中，藥物終劑量均為100 μg/kg。兔多抗Twist1抗體和sc-15393均購自Santa Cruz公司，工作濃度為1∶50。

1.2 方法

1.2.1 B16黑色素瘤小鼠模型的建立及分組 將低溫保存的B16黑色素瘤組織于43℃的熱水中迅速升溫20~30 s，然后以1 000 r/min離心10 min，吸取上清液后，剪碎瘤組織，加入生理鹽水制成瘤細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×109/L）。于小鼠蹊部注射瘤細(xì)胞懸液0.2 mL/只。待小鼠荷瘤后隨機(jī)分為Caspase 8抑制劑組（8抑制劑組），Caspase 9抑制劑組（9抑制劑組），Caspase 8、9抑制劑聯(lián)合用藥組（聯(lián)合組）及對照組,每組24只。

1.2.2 給藥方法 （1）8抑制劑組：于小鼠瘤周皮下注射Cas?pase 8抑制劑0.1 mL/d。（2）9抑制劑組：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 9抑制劑0.1 mL/d。（3）聯(lián)合組：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 8抑制劑0.1 mL/d和Caspase 9抑制劑0.1 mL/d。（4）對照組：于小鼠瘤周皮下注射含10%DMSO的生理鹽水0.1 mL/d。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 斷頸法處死小鼠后剖取移植瘤，福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，采用二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，抗原微波熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗4℃冰箱過夜，二抗1 h，DAB顯色10~15 min，蘇木精復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 計(jì)數(shù)方法 在低倍鏡（×100）下找到典型區(qū)域，高倍鏡（×400）下連續(xù)計(jì)數(shù)10個高倍視野中LPPCN周圍和VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核和胞漿的染色指數(shù)，取其平均值[4]。染色指數(shù)=陽性率積分+染色強(qiáng)度。陽性率積分的評定：陽性率<25%為0分，26%~50%為1分，51%~75%為2分，≥76%為3分；染色強(qiáng)度評定：腫瘤細(xì)胞無著色為0分，染成淺黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色為3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Twist1在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中皆有表達(dá)，見圖1。4組LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1，且有逐層遞減趨勢，見表2；同層不同組的LPPCN腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)，聯(lián)合組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見表1。LPPCN和VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞、同一層不同組的腫瘤細(xì)胞胞漿,VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞、同一層不同組的腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表3~5。

表1 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24x±s）

表1 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24x±s）

*P<0.05，**P<0.01

?

表2 同一組別不同層兩兩比較的P值

表3 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞漿Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24， ±s）

表3 LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞漿Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24， ±s）

均P>0.05，表3、4同

組別8抑制劑組9抑制劑組聯(lián)合組對照組F第1層4.45±0.17 5.00±0.21 4.90±0.15 5.27±0.15 2.488第2層4.57±0.16 5.00±0.20 4.91±0.15 5.18±0.16 2.292第3層4.88±0.18 5.00±0.15 4.59±0.14 5.23±0.19 0.062第4層4.88±0.18 4.91±0.19 4.64±0.16 5.09±0.16 2.262 F 0.096 0.054 1.309 0.226

表4 VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24±s）

表4 VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24±s）

組別8抑制劑組9抑制劑組聯(lián)合組對照組F第1層5.13±0.30 5.43±0.30 5.33±0.24 5.38±0.26 0.233第2層4.88±0.23 5.29±0.29 5.11±0.31 5.00±0.42 0.275第3層4.63±0.32 5.14±0.34 4.78±0.36 4.88±0.23 0.426第4層4.63±0.38 5.14±0.34 4.78±0.37 4.50±0.27 0.608 F 0.906 0.189 0.711 1.406

表5 VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞漿Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24 ±s）

表5 VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞漿Twist1陽性染色指數(shù)的比較 （n=24 ±s）

組別8抑制劑組9抑制劑組聯(lián)合組對照組F第1層5.10±0.18 5.32±0.22 4.76±0.15 5.33±0.14 2.186第2層4.95±0.19 5.22±0.26 4.64±0.18 5.23±0.15 1.756第3層4.86±0.16 4.91±0.21 4.55±0.18 4.95±0.19 1.120第4層4.95±0.15 4.96±0.21 4.45±0.17 5.05±0.19 2.105 F 0.35 0.76 0.57 1.01

3 討論

VM是Maniotis等[5]發(fā)現(xiàn)的一種不依賴于血管內(nèi)皮的腫瘤微循環(huán)模式。在腫瘤快速生長早期，腫瘤組織內(nèi)部處于高壓、缺氧狀態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞很難長入腫瘤組織，因此EV生長無法滿足腫瘤細(xì)胞快速生長的需要。VM的形成可有效緩解腫瘤快速生長早期腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的缺氧狀態(tài)。此后VM逐漸被EV所取代，馬賽克血管（Mosaic Vessels，MV）則是處于VM和EV過渡階段的血液供應(yīng)模式，這就是腫瘤血管生成的三階段學(xué)說[4]。因此VM是腫瘤組織生長早期重要的功能性血管，可有效地改善腫瘤內(nèi)部的缺氧環(huán)境，與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中存在一些深染的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞呈線形分布或網(wǎng)狀分布，胞核深染、碎裂、胞漿濃縮、細(xì)胞間彼此分離，并與內(nèi)皮依賴性血管相通[2]，這些深染的腫瘤細(xì)胞被命名為LPPCN。與凋亡和壞死這2種經(jīng)典的細(xì)胞死亡模式不同，LPPCN是主動性的，腫瘤細(xì)胞群體發(fā)生的，并且沒有炎細(xì)胞浸潤的腫瘤細(xì)胞死亡模式。在LPPCN過程中，Caspases發(fā)揮著重要作用[6-7]。發(fā)生LPPCN的腫瘤細(xì)胞原位缺口末端標(biāo)記染色陰性，Caspase 3、Caspase 9免疫組織化學(xué)染色陽性[1]。發(fā)生LPPCN的腫瘤細(xì)胞死亡脫落后形成的管腔樣空隙可能為VM、EV的形成提供一定的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1]。LPPCN常發(fā)生于血液供應(yīng)無法到達(dá)、缺氧最嚴(yán)重的腫瘤細(xì)胞，而LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細(xì)胞則處于相對缺氧狀態(tài)，這些瀕死的腫瘤細(xì)胞可能啟動一系列機(jī)制發(fā)生EMT，對抗缺氧微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后上皮細(xì)胞喪失上皮特性，即細(xì)胞間黏附能力和細(xì)胞極性的喪失，同時獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，即細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力和抗凋亡能力的增強(qiáng)[8-9]。在缺氧環(huán)境下缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）1高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，不僅發(fā)生了形態(tài)學(xué)上的改變，還具有了自分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的能力，為VM的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

參與EMT過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子主要有Twist1、Snail和Slug等。Twist1是一種螺旋-環(huán)-螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Twist1可以與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄啟動子E-box結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。將胰腺癌細(xì)胞系放置于缺氧環(huán)境48 h后，Twist1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)[10]。有研究表明轉(zhuǎn)染Slug的犬腎細(xì)胞系高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和Twist1[11]。在97例肝細(xì)胞肝癌樣本中VM陽性組Twist1表達(dá)明顯強(qiáng)于VM陰性組，轉(zhuǎn)染Twist1的HepG2肝癌細(xì)胞系E-cadherin表達(dá)下調(diào)，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并且在體外培養(yǎng)時形成了管腔樣結(jié)構(gòu)[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過抑制Caspase 8、9來干擾LPPCN的形成，破壞腫瘤早期微環(huán)境的構(gòu)建加重腫瘤組織內(nèi)部缺氧程度，促使腫瘤組織發(fā)生大片壞死，從而下調(diào)LPPCN周圍尤其是第1~4層腫瘤細(xì)胞Twist1的表達(dá)，其中Caspase 8、9抑制劑聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞核Twist1下調(diào)更顯著，LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核Twist1表達(dá)呈遞減趨勢。但LPPCN周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞漿Twist1表達(dá)無遞減趨勢，且VM周圍第1~4層腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞漿中Twist1表達(dá)此種趨勢并不明顯，可能與VM形成后改善腫瘤細(xì)胞局部缺氧微環(huán)境有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明LPPCN周圍腫瘤細(xì)胞在缺氧的誘導(dǎo)下可上調(diào)細(xì)胞核Twist1表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可能在一系列機(jī)制的誘導(dǎo)下自分泌多種細(xì)胞因子并重塑細(xì)胞外基質(zhì)促使VM的最終形成。

在腫瘤組織快速生長早期，內(nèi)皮依賴性血管無法滿足腫瘤生長需要，VM的形成對緩解腫瘤細(xì)胞局部缺氧微環(huán)境起重要作用。此外，VM形成還有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。單純針對內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成治療在部分高度惡性腫瘤中沒有達(dá)到預(yù)期效果，可能與腫瘤組織內(nèi)存在VM這種獨(dú)特的微循環(huán)模式有關(guān)。研究VM及其形成機(jī)制將有可能為臨床腫瘤抗血管生成治療提供藥物新靶點(diǎn)。

[1]Zhang S,Guo H,Zhang D,et al.Microcirculation patterns in different stages of Melanoma growth[J].Oncology Report,2006,15(1):15-20.

[2]Zhang S,Li M,Zhang D,et al.Hypoxia influences linearly patterned programmed cell necrosis and tumor blood supply patterns forma?tion in melanoma[J].Lab Invest,2009,89(5):575-586.

[3]Sun T,Zhao N,Zhao XL,et al.Expression and functional signifi?cance of twist1 in hepatocellular carcinoma:its role in vasculogenic mimicry[J].Hepatology,2010,51(2)545-556.

[4]Hendrix MJ,Seftor EA,Hess AR,et al.Vasculogenic mimicry and tumor-cell plasticity:lessons from melanoma[J].Nat Rev Cancer,2003,3(6):411-421.

[5]Manitois AJ,Folberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol,1999,155(3):739-752.

[6]Shimizu S,Eguchi Y,Kamiile W,et al.Retardation of chemical hy?poxia-induced necrotic cell death by Bcl-2 and ICE inhibitors:pos?sible involvement if common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction[J].Oncogene,1996,12(10):2045-2050.

[7]Tsujimoto Y.Apoptosis and necrosis:intracellular ATP level as a de?terminant for cell death modes[J].Cell Death Differ,1997,4(6):429-434.

[8]Greenberg G，Hay ED.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells[J].J Cell Biol,1982,95(1):333-339.

[9]Fardin P,Ognibene M,Vanni C,et al.Induction of epithelial mes?enchimal transition and vasculogenesis in the lenses of Dbl onco?gene transgenic mice[J].PLoS One，2009，4(9):e7058.

[10]Hotz B,Arndt M,Dullat S,et al.Epithelia to mesenchymal transi?tion:expression of the regulators snail,slug and twist in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res，2007，13(16):4769-4776.

[11]Huang CH,Yang WH,Chang SY,et al.Regulation of membrane-type 4 matrix metalloproteinase by SLUG contributes to hypoxia-mediated metastasis[J].Neoplasia，2009,11(12):1371-1382.