肌肉來(lái)源干細(xì)胞表面抗原-1陽(yáng)性與陰性細(xì)胞體外培養(yǎng)成肌特性的比較

車曉霞 趙彤 朱玲玲 郭杰

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院 正畸科，北京 100050；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 腦保護(hù)與可塑性研究室，北京 100850；3.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科；山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250012）

干細(xì)胞表面抗原-1（stem cell antigen-1，Sca-1）作為一種細(xì)胞表面標(biāo)記常用于富集干細(xì)胞和前體細(xì)胞，最早發(fā)現(xiàn)于小鼠激活的淋巴細(xì)胞[1]，是一種由鼠Ly6基因家族編碼，以糖基磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞表面蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為18 000，定位于漿膜的脂質(zhì)載體[2]。

骨骼肌受到損傷后，在骨骼肌局部存留的干細(xì)胞和肌肉形成前體細(xì)胞激活、增殖、分化并融合形成多核肌細(xì)胞，修復(fù)或替代受損的組織[3-4]。這對(duì)于維持骨骼肌在運(yùn)動(dòng)和老化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)平衡非常重要。實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)Sca-1的細(xì)胞在體內(nèi)和體外都可以分化為骨骼肌，也可以生成造血細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞[5-6]。在細(xì)胞移植治療中，Sca-1+細(xì)胞存活率高[7]，靶基因治療效果好，但目前對(duì)這種細(xì)胞表面蛋白的功能尚不明了。

成肌調(diào)節(jié)因子（muscle regulatory factor，MRF）在肌肉細(xì)胞種系決定和分化中起重要作用。其中MyoD和成肌素（Myogenin）都屬于MRF，MyoD作為原發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子，在成肌種系決定中起作用[8]，見于激活的衛(wèi)星細(xì)胞；Myogenin作為繼發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子，在肌肉終末分化時(shí)表達(dá)[9]。本研究對(duì)比觀察了Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)特性及MRF表達(dá)的特點(diǎn)，希望獲得實(shí)驗(yàn)線索以說(shuō)明Sca-1在細(xì)胞增殖分化過(guò)程中所發(fā)揮的功能作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠原代成肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將4周齡C57BL/6小鼠脫頸處死，75%乙醇消毒小鼠后肢皮膚，剪開皮膚，剔去脂肪和筋膜，剪取后肢肌肉組織，立即放入預(yù)冷的DMEM中漂洗3次。將肌肉小塊轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的小燒杯中，用眼科剪充分剪碎成漿狀，加入組織混合酶（2.4 U·mL-1分散酶、0.2%Ⅱ型膠原酶、2.5mmol·L-1CaCl2），37℃消化45min，每間隔15min用吸管反復(fù)吹吸若干次。用含20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的生長(zhǎng)液終止消化，200目細(xì)胞篩選過(guò)濾，1 400 r·min-1離心10min，棄去上清，按照密度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞懸于200μL的PBS中，等待流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分選。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代成肌細(xì)胞中Sca-1的表達(dá)

將從小鼠骨骼肌中獲得的新鮮成肌細(xì)胞以密度為每毫升1×106個(gè)懸于200μL的PBS中，加入藻紅蛋白標(biāo)記的Sca-1單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnologies公司，美國(guó)），37℃孵育30min，用含體積分?jǐn)?shù)0.1%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS洗滌、重懸細(xì)胞，移入專用測(cè)試管，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca-1的表達(dá)，采用聯(lián)機(jī)專用軟件Cell Quest進(jìn)行分析。此外按照流式細(xì)胞儀儀器手冊(cè)設(shè)置各項(xiàng)參數(shù)，安裝分選器，將上述細(xì)胞進(jìn)行分選，分別收集Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞。

1.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

生長(zhǎng)曲線是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采取CCK-8試劑盒測(cè)定光密度值（A值），間接測(cè)量活細(xì)胞數(shù)量。將流式細(xì)胞儀分選獲得的Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞分別以密度為每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組20孔。培養(yǎng)1、3、5 d后向各孔中加入10μL的CCK-8溶液，37℃孵育4 h，直接測(cè)定450 nm處的A值，繪制曲線。

1.4 Western blot檢測(cè)成肌蛋白的表達(dá)

為了對(duì)比小鼠骨骼肌來(lái)源Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中從增殖到分化的變化，采用Western blot檢測(cè)Sca-1、MyoD、Myogenin的蛋白表達(dá)。將Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞分別以密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞接種到涂布過(guò)鼠尾膠原的60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為高糖DMEM（含有20%FBS、1%青鏈霉素、2.5 ng·mL-1堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子），細(xì)胞培養(yǎng)4 d后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，PBS清洗，離心，加入細(xì)胞蛋白裂解液，冰上裂解30min，提取蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

常規(guī)制備10%SDS-PAGE分離膠，混勻后，將其灌入預(yù)先制備好的制膠板內(nèi)（Bio-Rad公司的Mini-Cell制膠系統(tǒng)），用水覆蓋，室溫凝固30min。制備5%SDS-PAGE濃縮膠，混勻后，灌膠并置室溫凝固30min。電泳首先以8 V·cm-1進(jìn)行，待上樣緩沖液進(jìn)入分離膠后調(diào)整為15V·cm-1，電泳時(shí)間約2 h；隨后以60 V的恒壓進(jìn)行硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)時(shí)間視被轉(zhuǎn)移蛋白的大小而定。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于TBS中漂洗，5%脫脂奶粉（北京普利萊公司）封閉，經(jīng)TBS充分振蕩清洗后，分別滴加一、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體），DAB顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖能力的測(cè)定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代細(xì)胞中Sca-1的陽(yáng)性表達(dá)率為64.86%，分選后分別進(jìn)行Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞的體外培養(yǎng)，經(jīng)CCK-8試劑盒測(cè)定2種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見圖1。在培養(yǎng)過(guò)程中，前3 d Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞增殖速率沒有明顯差別，第3天后Sca-1-細(xì)胞開始加速增殖。

2.2 Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中Sca-1、Myo-D、Myogenin的蛋白表達(dá)

Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中Sca-1、Myo-D、Myogenin的蛋白表達(dá)結(jié)果見圖2。由圖2可見，Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中Sca-1表達(dá)均不明顯，Sca-1+細(xì)胞比Sca-1-細(xì)胞MyoD、Myogenin表達(dá)強(qiáng)，說(shuō)明Sca-1+比Sca-1-細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中具有更好的成肌特性。

3 討論

從不同的組織中都可以分離出具有干細(xì)胞特征的Sca-1+細(xì)胞[10]。在體外培養(yǎng)骨骼肌來(lái)源成肌細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Sca-1+與Sca-1-細(xì)胞在體外培養(yǎng)5 d的過(guò)程中Sca-1均未見明顯表達(dá)。Jankowski等[11]研究也顯示細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Sca-1表達(dá)下降。以Sca-1表達(dá)為標(biāo)記純化出來(lái)的成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)5 d，Sca-1表達(dá)消失。這些結(jié)果說(shuō)明，Sca-1的出現(xiàn)是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一個(gè)時(shí)段的表達(dá)特征，以此作為標(biāo)記進(jìn)行干細(xì)胞篩選可能會(huì)產(chǎn)生一定的局限性。

盡管對(duì)于Sca-1在細(xì)胞生命活動(dòng)的作用尚不了解，但是很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻支持Sca-1的細(xì)胞信號(hào)功能[12-13]。Sca-1基因沉默小鼠和骨骼肌成肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)顯示Sca-1在成肌細(xì)胞增殖、分化、融合中發(fā)揮作用。對(duì)于體外培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞，給予Sca-1抗體阻斷，其功能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制成肌細(xì)胞融合。從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度來(lái)看，分別在Sca-1+和Sca-1-鼠骨骼肌中形成壞死性損傷，Sca-1-成肌細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)和加速的細(xì)胞分裂，表現(xiàn)為高度的增殖反應(yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)增殖能力的檢測(cè)結(jié)果也說(shuō)明Sca-1-比Sca-1+細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。

Sca-1對(duì)于成肌細(xì)胞增殖分化的作用可能與對(duì)細(xì)胞進(jìn)出細(xì)胞周期的影響有關(guān)。通過(guò)基因芯片實(shí)驗(yàn)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在成肌細(xì)胞早期分化進(jìn)行過(guò)程中，細(xì)胞離開細(xì)胞循環(huán)時(shí)，包括DDAH2和Sca-1等幾個(gè)基因表達(dá)特異性上調(diào)[12]；當(dāng)細(xì)胞開始分化時(shí)Sca-1表達(dá)出現(xiàn)暫時(shí)性升高[14]。有學(xué)者認(rèn)為，成肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與細(xì)胞分裂相排斥[13]，MyoD的功能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21[15-16]，同時(shí)伴隨其他Cip1/Kip1家族成員p57和p27，廣泛抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，從而使細(xì)胞停止分裂[17]。Myogenin則在肌肉終末分化時(shí)表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Sca-1+比Sca-1-細(xì)胞表達(dá)更多的MyoD和Myogenin。從以往的研究結(jié)果可以推測(cè)得出解釋：雖然從骨骼肌中分離出來(lái)的成肌細(xì)胞表達(dá)Sca-1，但其中一部分可能是已經(jīng)走出細(xì)胞周期，開始了早期分化細(xì)胞，因而直接表達(dá)成肌分化蛋白；而Sca-1-成肌細(xì)胞表現(xiàn)出的高度增殖反應(yīng)導(dǎo)致成肌細(xì)胞分化延遲。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步提示，如果以Sca-1為標(biāo)記分離出來(lái)的細(xì)胞可能是還沒有進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的干細(xì)胞，或者是已經(jīng)進(jìn)入早期分化階段的成肌細(xì)胞。

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