細胞角蛋白17在口腔鱗癌中的表達

魏魁杰 張雷 楊筱 韓偉 鐘來平 葉冬霞 張志愿

（1.湖州師范學院醫(yī)學院 口腔系，湖州 313000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 口腔頜面外科，上海 200011）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，患者5年生存率約為50%，對于腫瘤晚期和復發(fā)患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的生物標志物、闡明其發(fā)病機制十分重要。

本研究利用口腔黏膜上皮體外癌變模型[2-3]，在前期工作中采用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)，鑒定出癌變形成細胞較永生化細胞高表達的細胞角蛋白17（cytokeratin 17，CK17）。CK17是構(gòu)成細胞骨架的一種酸性多肽，在乳腺癌、子宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達[4-7]。本研究旨在探討CK17在口腔黏膜上皮體外癌變模型、口腔鱗癌細胞株及臨床組織標本中的表達情況及臨床意義，以期為口腔鱗癌的診斷和預防提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材

細胞培養(yǎng)基Defined keratinocyte-SFM、DMEM和RPMI-1640（Gibco公司，美國），RNA提取試劑（Invitrogen公司，美國），實時熒光定量試劑盒（TaKaRa公司，日本），Western鼠抗熒光抗體（Fermentas公司，立陶宛），EnVision鼠兔共抗二抗（Dako Cytomation公司，丹麥），CK17鼠抗人單克隆抗體（Millipore公司，美國），Odyssey激光成像分析系統(tǒng)（LI-COR Biosciences公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

口腔黏膜上皮體外癌變模型中的永生化細胞（human immortalized oral epithelia cell，HIOEC）、HB56及HB96細胞、舌鱗癌細胞株Tca8113均由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，舌鱗癌細胞株TSCC由武漢大學口腔醫(yī)學院建系并惠贈，CAL27購自美國American Type Culture Collection（ATCC）公司，口腔鱗癌細胞株OSC由日本高知大學醫(yī)學院惠贈。HIOEC采用Defined keratinocyte-SFM培養(yǎng)，HB56、HB96和CAL27采用DMEM（含10%FBS，2×105U·L-1青、鏈霉素）培養(yǎng)，Tca8113、TSCC、OSC細胞用RPMI-1640（含10%FBS，2×105U·L-1青、鏈霉素）培養(yǎng)。所有細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 組織標本

選取2007年2—7月上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的原發(fā)口腔鱗癌組織標本30例，患者術(shù)前未經(jīng)過放、化療，且均知情同意。30例患者中，男性21例，女性9例；年齡31～84歲，平均年齡53.8歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union Internationale Contre Le Cancer，UICC）2002分類，T1 6例，T2 13例，T3 4例，T4 7例；N0 16例，N1-2 14例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ級（早期）13例，Ⅲ、Ⅳ級（晚期）17例；病理分級：高分化12例，中分化15例，低分化3例。術(shù)中切取腫瘤實體內(nèi)組織和腫瘤邊界2 cm外的癌旁組織立即投入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，癌旁組織經(jīng)病理證實為正常黏膜組織。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應

待細胞豐度至70%～80%，按1×107收集細胞，移入1.5mL離心管中；取組織塊約50mg置研缽中，加入液氮后迅速研磨成粉末狀，分別加入1mL Trizol，根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟分別抽提各細胞及癌與癌旁組織總RNA，測定質(zhì)量濃度。取2μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用20μL反應體系，以cDNA為模板進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增CK17上游序列：5’-GAGATTGCCACCTACCGC-3’，下游序列：5’-TGCCATCCTGGACCTCTT-3’，擴增片段的長度為118 bp。內(nèi)參照β-肌動蛋白上游序列：5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’，下游序列：5’-GGTTTTGTCAAGAAAGGGTGTAACG-3’，擴增片段的長度為100bp。反應條件為：預變性95℃、10 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個循環(huán)，β-肌動蛋白作為內(nèi)參照，實驗重復3次。根據(jù)Livak等[8]推導的2-ΔΔCt分別計算細胞系中目的基因相對內(nèi)參基因的相對表達量以及口腔鱗癌癌組織相對癌旁組織中目的基因的相對表達量。

1.5 免疫印跡反應

待細胞長至70%～80%匯合，每1×107細胞加入1mL預冷的2×組織細胞蛋白裂解液（含125mmol·L-1Tris-HCl、5%十二烷基硫酸鈉、24.75%甘油）提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，每孔總蛋白上樣量50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的鼠抗人CK17單克隆抗體4℃孵育過夜。經(jīng)過含0.1%Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，與1∶1 000稀釋的熒光二抗在室溫下孵育1 h。采用Odyssey激光成像分析系統(tǒng)進行掃描，測定電泳條帶的積分密度值，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照。

1.6 免疫組化檢測

石蠟連續(xù)切片4μm，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2作用20min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol·L-1pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液水浴加熱法抗原修復，滴加1∶100稀釋的CK17鼠抗人的單克隆抗體50μL，濕盒內(nèi)4℃過夜，次日室溫下復溫1 h；滴加EnVision鼠兔共抗二抗50μL，室溫孵育40min；0.04%DAB顯色1～5min，鏡下控制反應時間；蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。CK17的染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)生采用雙盲法鏡檢，根據(jù)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例計算陽性表達率，結(jié)果記錄：陰性記為0分，1%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～100%記為3分。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，對癌組織與癌旁組織中CK17 mRNA表達進行單樣本t檢驗，對CK17的表達水平與口腔鱗癌患者臨床病理指標之間的關(guān)系、癌組織與癌旁組織中CK17蛋白的表達進行非參數(shù)分析配對樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CK17 mRNA和蛋白在體外癌變模型和口腔鱗癌細胞株中的表達

實時定量PCR反應檢測結(jié)果：與永生化HIOEC細胞相比，CK17 mRNA在HB56和OSC細胞株中表達明顯升高，而在HB96、Tca8113、TSCC和CAL27細胞中有不同程度的降低（圖1）。Western blot印跡檢測結(jié)果：與永生化HIOEC細胞相比，CK17蛋白表達水平在HB細胞及所有口腔鱗癌細胞株中均有不同程度的升高（圖2，3）。

2.2 CK17 mRNA在口腔鱗癌組織標本中的表達

對30例口腔鱗癌癌組織相對于癌旁組織中CK17基因的表達變化倍數(shù)進行分析：口腔鱗癌組織中CK17 mRNA水平是癌旁組織的（3.041±3.504）倍，癌組織中CK17基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于癌旁組織（t=3.191，P=0.003）。CK17的表達水平與口腔鱗癌患者臨床病理指標之間的關(guān)系見表1。

在分析口腔鱗癌中CK17基因水平與各臨床病理指標關(guān)系時，僅發(fā)現(xiàn)直徑大小不同的腫瘤間CK17 mRNA水平呈差異表達（P=0.035），但是進一步研究發(fā)現(xiàn)這種差異表達并未呈現(xiàn)出一種趨勢，即隨著腫瘤直徑的增加，CK17 mRNA表達上升或下調(diào)，另外，CK17 mRNA表達水平與其他臨床病理指標間均無明顯相關(guān)性（表1）。

2.3 CK17蛋白在口腔鱗癌組織標本中的表達

口腔鱗癌患者的癌組織和癌旁組織中CK17蛋白表達情況見表2和圖4。在癌旁組織中，CK17蛋白的染色稍淺，陽性細胞率稍低；而在癌組織中CK17均為陽性表達，染色較深，主要表達在細胞漿中。用非參數(shù)分析配對樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗，Z=-3.892，P＜0.001，二者之間的差異有統(tǒng)計學意義，表明口腔鱗癌患者癌組織中CK17陽性表達程度顯著高于癌旁組織。CK17蛋白的表達與煙酒嗜好、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分化程度均無明顯相關(guān)性。

表2 30例口腔鱗癌癌組織和癌旁組織中CK 17蛋白表達Tab 2 The CK 17 protein expression in cancerous and para-cancerous tissues from 30 OSCC patients

3 討論

口腔鱗狀細胞癌的致癌過程是一個多因素、多步驟發(fā)展的過程，在生物因素、化學因素和血清中生長因子等多種因素的作用下，多種蛋白水平發(fā)生改變，出現(xiàn)細胞異常增殖，導致腫瘤形成。本課題前期研究已建立了國內(nèi)第一株人永生化口腔上皮細胞株HIOEC[2]，并利用苯丙芘誘導HIOEC細胞，形成具有裸鼠皮下成瘤能力等惡性表型的HB細胞株，包括HB56、HB96細胞，從而建立了人口腔黏膜上皮細胞體外癌變細胞模型[3]。從HIOEC到HB細胞惡性轉(zhuǎn)化過程可能伴隨一些重要的基因表達或功能變化，本課題組在前期工作中應用比較蛋白質(zhì)組學方法，從HIOEC和HB細胞中鑒定出50多個差異表達蛋白，CK17是其中之一[9]。

為了驗證比較蛋白質(zhì)組學結(jié)果，本研究應用實時定量PCR和免疫印跡方法檢測CK17 mRNA和蛋白在體外癌變模型和口腔鱗癌細胞株中的表達。結(jié)果顯示：相對于HIOEC細胞，CK17 mRNA在HB56和OSC中表達上調(diào)，而在HB96及其他口腔鱗癌細胞株中有不同程度的降低，CK17蛋白在HB56、HB96和所有口腔鱗癌細胞株中均有不同程度的升高，提示CK17的表達上升可能在口腔鱗癌細胞株中是普遍現(xiàn)象。Lalli等[10]研究表明：在癌前病變口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF）中CK17蛋白表達上升，且與病變嚴重程度有關(guān)。上述研究結(jié)果均表明CK17可能在口腔鱗癌的發(fā)生過程中起到一定的作用。

對臨床標本的研究結(jié)果顯示：癌組織中CK17 mRNA和蛋白的表達均明顯高于癌旁組織，與比較蛋白質(zhì)組學及細胞株中免疫印跡結(jié)果一致，也與其他學者[4-7]在乳腺癌、子宮頸癌、肺癌等惡性腫瘤中的研究結(jié)果相一致。本研究中也發(fā)現(xiàn)無論從基因還是蛋白水平上，CK17的表達與各臨床病理指標之間均無明顯相關(guān)性。而在既往的口腔鱗狀細胞癌的研究中，有學者[11-12]發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標本中CK17 mRNA表達升高，認為可以利用檢測CK17 mRNA表達水平來預測是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

以上研究結(jié)果表明：CK17在口腔黏膜上皮癌變過程中表達上調(diào)可能與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為口腔鱗癌早期診斷的檢測指標。當然本研究也發(fā)現(xiàn)在細胞學水平上CK17存在基因和蛋白表達不同步的現(xiàn)象，與Sesterhenn等[13]在頭頸部鱗癌中的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)在15種頭頸部鱗癌細胞株中，只有3株CK17 mRNA高表達，1株CK17蛋白高表達，而在15例頭頸鱗癌組織標本中10例標本CK17 mRNA高表達，所有標本CK17蛋白高表達。這種基因和蛋白表達不同步的現(xiàn)象，可能與基因轉(zhuǎn)錄后的修飾如甲基化、磷酸化或泛素化有關(guān)，今后還需要進一步采用基于基因轉(zhuǎn)染和小RNA干擾等手段的基因功能研究和長期大量的臨床病例隨訪研究，以闡明CK17在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55（2）：74-108.

[2]張志愿,帕提曼·司地克,曹俊,等.16型人乳頭狀瘤病毒E6、E7誘導的人永生化口腔上皮細胞系的建立[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2002,37（1）：12-14.Zhang Zhiyuan,Sdek Patima,Cao Jun,et al.Establishment of human immortalized oral epithelial cell line HIO615 induced by HPV16 E6 and E7[J].Chin J Stomatol,2002,37（1）：12-14.

[3]潘紅芽,張志愿,周曉健,等.口腔黏膜上皮細胞體外癌變模型的建立[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2006,41（1）：20-24.Pan Hongya,Zhang Zhiyuan,Zhou Xiaojian,et al.The establishment of a carcinogenesis model of oral squamous cell carcinoma in vitro[J].Chin J Stomatol,2006,41（1）：20-24.

[4]Cohen-Kerem R,Madah W,Sabo E,et al.Cytokeratin-17 as a potentialmarker for squamous cell carcinoma of the larynx[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2004,113（10）：821-827.

[5]van de Rijn M,Perou CM,Tibshirani R,et al.Expression of cytokeratins 17 and 5 identifies a group of breast carcinomas with poor clinical outcome[J].Am J Pathol,2002,161（6）：1991-1996.

[6]Carrilho C,Alberto M,Buane L,et al.Keratins 8,10,13,and 17 are useful markers in the diagnosis of human cervix carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35（5）：546-551.

[7]Wetzels RH,Schaafsma HE,Leigh IM,et al.Laminin and typeⅦcollagen distribution in different types of human lung carcinoma：Correlation with expression of keratins 14,16,17 and 18[J].Histopathology,1992,20（4）：295-303.

[8]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods,2001,25（4）：402-408.

[9]鐘來平,潘紅芽,葉冬霞,等.用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選口腔黏膜上皮細胞體外癌變的相關(guān)蛋白[J].中國口腔頜面外科雜志,2010,8（3）：235-240.Zhong Laiping,Pan Hongya,Ye Dongxia,et al.Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the in vitro cellular carcinogenesis model of oral mucosal epithelial cells[J].Chin J Oral Maxillofac Surg,2010,8（3）：235-240.

[10]Lalli A,Tilakaratne WM,Ariyawardana A,et al.An altered keratinocyte phenotype in oral submucous fibrosis：Correlation of keratin K17 expression with disease severity[J].J Oral Pathol Med,2008,37（4）：211-220.

[11]Toyoshima T,Vairaktaris E,Nkenke E,et al.Cytokeratin 17 mRNA expression has potential for diagnostic marker of oral squamous cell carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134（4）：515-521.

[12]Garrel R,Dromard M,Costes V,et al.The diagnostic accuracy of reverse transcription-PCR quantification of cytokeratin mRNA in the detection of sentinel lymph node invasion in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma：A comparison with immunohistochemistry[J].Clin Cancer Res,2006,12（8）：2498-2505.

[13]Sesterhenn AM,Mandic R,Dünne AA,et al.Cytokeratins 6 and 16 are frequently expressed in head and neck squamous cell carcinoma cell lines and fresh biopsies[J].Anticancer Res,2005,25（4）：2675-2680.