金屬柵欄式腭器官培養(yǎng)模型的建立

盧勝軍 何葦 石冰 蒙田 李承浩 封興華

（1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 頜面外科，西安 710032；2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041）

腭器官體外培養(yǎng)是研究腭裂發(fā)病機(jī)制的一條重要途徑，相比單一的腭胚突上皮細(xì)胞或腭間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，它避免了單一細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷，可從立體結(jié)構(gòu)上研究腭的發(fā)生、發(fā)展以及調(diào)控機(jī)制，而且其排除了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜環(huán)境以及諸多干擾因素，成為目前研究腭裂發(fā)病機(jī)制的重要手段。

與細(xì)胞培養(yǎng)相比，腭器官培養(yǎng)需要消耗大量氧氣，因而腭器官不能完全浸沒(méi)在液體里面。本實(shí)驗(yàn)采用妊娠14 d的孕鼠，獲取胚胎，解剖腭器官，采用金屬隔柵式培養(yǎng)法，觀察腭器官在體外的發(fā)育過(guò)程，以期為研究腭裂發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)良好模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只成年C57BL/6J小鼠購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF飼養(yǎng)，室溫控制在20～25℃，充足食物，自由飲水。按雌雄比例2∶1交配，次日發(fā)現(xiàn)有陰道栓者定為妊娠0 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清FBS（Hyclone公司，美國(guó)），35mm培養(yǎng)皿（Falcon公司，法國(guó)）。

1.3 金屬支架的制備

用不銹鋼網(wǎng)自備支架，支架高約1.5 cm，上覆蓋一微孔濾膜，孔徑0.8μm，置于金屬網(wǎng)上。最后將此裝置放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)基，剛好浸沒(méi)過(guò)濾膜。

1.4 胚胎的獲取以及腭器官的解剖分離

于妊娠14 d，即小鼠雙側(cè)腭板相互接觸期，無(wú)菌條件下處死孕鼠，將胚胎獲取后，置于PBS液里面，充分沖洗，去除血漬。在體視顯微鏡下沿一側(cè)口角入路，去除舌體以及下頜后，獲取腭器官，置于微孔濾膜上，腭面朝上，鼻面朝下，雙側(cè)腭突緊密接觸，這樣使得腭突在得到充足的氧氣供給的同時(shí)，也可以獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)液的支持。將放有腭器官的金屬柵欄，置于35mm的培養(yǎng)皿里面，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（含鏈霉素100U·mL-1，青霉素100U·mL-1）。最后將整個(gè)裝置放置于37℃，5%CO2孵箱里面進(jìn)行培養(yǎng)。每隔12 h換液1次,分別培養(yǎng)24 h或是48 h。

1.5 蘇木精-伊紅染色以及光鏡觀察

分別在培養(yǎng)過(guò)程中24和48 h取出樣本，用4%的中性多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋，5μm切片，蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察。

2 結(jié)果

腭器官培養(yǎng)24 h以及48 h后，培養(yǎng)基液體澄清，器官濕潤(rùn)，有光澤，外觀呈現(xiàn)粉紅色。蘇木精-伊紅染色后發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)24h后兩側(cè)中脊上皮連續(xù)完整，并未消失，上皮細(xì)胞著色較深。間充質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)細(xì)胞壞死，輪廓分明，相比成體細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞核較多，細(xì)胞分裂旺盛，可見(jiàn)分裂的細(xì)胞核（圖1）。培養(yǎng)48 h后，中脊上皮消失，雙側(cè)腭板完全融合（圖2）。

3 討論

雙側(cè)腭突的融合包含了2個(gè)階段：第一是腭突從垂直向上升至水平相，第二是水平相的雙側(cè)腭突相互接觸并最終融合形成繼發(fā)腭。腭胚突在體外融合的能力因胚胎的年齡及種屬來(lái)源而異[1-2]。腭器官體外培養(yǎng)模型的建立一方面排除了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，便于單一觀察某個(gè)因子對(duì)于腭發(fā)育的影響[3]。而目前為止，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到金屬柵欄式腭器官培養(yǎng)模型的建立。

腭器官體外培養(yǎng)模型能夠模擬體內(nèi)腭器官的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4-5]。與細(xì)胞培養(yǎng)以及成體器官的培養(yǎng)相比，胚胎腭器官培養(yǎng)需要特殊的培養(yǎng)條件。如果器官完全浸沒(méi)于液體里面，器官將會(huì)因缺氧而壞死；如果完全放置在空氣里，其會(huì)因?yàn)槿狈ψ銐虻臓I(yíng)養(yǎng)液而無(wú)法存活。因此，如何將腭器官放置在一個(gè)液—?dú)庀蟮慕唤缑媸请衿鞴倥囵B(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。諸多學(xué)者為此嘗試了許多方法，比如腭器官的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法及瓊脂小島培養(yǎng)法等，但是上述方法所需過(guò)程復(fù)雜，并且腭器官的存活率不高。另外胚胎器官來(lái)源的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，遷移能力強(qiáng)，組織尚未完全分化，容易受外界的誘導(dǎo)而向其他方向分化生長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)的失敗。因此，為了維持器官的基本形態(tài)及結(jié)構(gòu)，需要添加某種抑制物來(lái)防止細(xì)胞的遷移以及組織的分化，因此，本實(shí)驗(yàn)將腭器官放在附有微孔濾膜的金屬絲網(wǎng)上，不僅可以抑制細(xì)胞遷移，同時(shí)可防止腭器官的下沉，這樣腭器官在獲得充足氧氣的同時(shí)，也得到了足夠的營(yíng)養(yǎng)液。該方法簡(jiǎn)單可行，為研究腭裂的發(fā)病機(jī)制建立了一種很好的模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)的腭突，中脊上皮連續(xù)性完好，間充質(zhì)細(xì)胞增生活躍，細(xì)胞輪廓清楚，活力好。經(jīng)過(guò)48h培養(yǎng)后，中脊上皮消失，雙側(cè)腭突間充質(zhì)細(xì)胞完全融合。目前，腭器官培養(yǎng)方法在不斷的改進(jìn)，其應(yīng)用也在不斷的深入，相信，其必將為腭裂發(fā)病機(jī)制的研究起到積極的作用。

[1]Pourtois M.Onset of the acquired potentiality for fusion in the palatal shelves of rats[J].J Embryol Exp Morphol,1966,16（1）：171-182.

[2]Vargas VI.Palatal fusion in vitro in the mouse[J].Arch Oral Biol,1967,12（11）：1283-1288.

[3]Gritli-Linde A.Molecular control of secondary palate development[J].Dev Biol,2007,301（2）：309-326.

[4]Koch WE,Smiley GR.In-vivo and in-vitro studies of the development of the avian secondary palate[J].Arch Oral Biol,1981,26（3）：181-187.

[5]Shimizu N,Aoyama H,Hatakenaka N,et al.An in vitro screening system for characterizing the cleft palate-inducing potential of chemicals and underlying mechanisms[J].Reprod Toxicol,2001,15（6）：665-672.