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    黃芪注射液對阿霉素中毒性心肌損傷小鼠心肌細胞線粒體膜電位及GSH的影響*

    2011-07-16 02:53:20梁麗英
    天津醫(yī)藥 2011年7期
    關(guān)鍵詞:膜電位阿霉素黃芪

    梁麗英 陳 晶 賀 毅

    阿霉素(adriamycin,ADM)用于治療各種惡性腫瘤。但是,由于其具有明顯的心臟毒性,臨床應用受到限制。阿霉素心臟毒性與心肌細胞凋亡有關(guān),在細胞凋亡過程中,線粒體起著關(guān)鍵性的作用。研究發(fā)現(xiàn),在細胞凋亡的早期階段,細胞發(fā)生病理改變前,線粒體膜電位就已經(jīng)下降,一旦線粒體跨膜電位崩潰,則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)[1]。黃芪注射液對細胞線粒體膜電位下降有抑制作用[2]。本研究旨在探討其拮抗阿霉素心臟毒性的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 阿霉素(注射用鹽酸多柔比星10 mg/瓶,浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號:090201B);黃芪注射液(2 g/mL,正大青春寶有限公司,批號:0901073)。JC-1細胞線粒體膜電位試劑盒(5 mg/瓶,美國Biovision,批號:ENZ-52304)。還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(100T,批號:20100302,南京建成生物工程技術(shù)有限公司)。

    1.2 實驗動物 昆明小鼠60只(廣西醫(yī)科大學動物實驗中心,SCXK桂-2003-0003),雄性,清潔級,體質(zhì)量18~20 g。

    1.3 儀器設(shè)備 流式細胞分析系統(tǒng)(美國BECKAN COUL?TER公司,型號:Epics XL);移液器(德國EPPENDORF公司);756型紫外分光光度計(上海菁華儀器廠)。

    1.4 實驗方法 采用隨機平行同期對照的方法,建立小鼠阿霉素中毒性心肌損傷(ADR)動物模型。60只小鼠按隨機數(shù)字表分為黃芪注射液治療組(大、中、小3個劑量組)、阿霉素模型組和正常對照組。正常對照組每日腹腔注射生理鹽水10 μL/g;阿霉素模型組,隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g;黃芪注射液治療組,隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g,另外大、中和小劑量組每日腹腔分別注射黃芪注射液12、6和3 μg/g。所有動物均自由飲食。連續(xù)給藥14 d。

    1.5 檢測指標與方法 (1)心臟系數(shù)測定:稱取小鼠體質(zhì)量,摘眼球取血,處死后取出心臟,用電子分析天平準確稱量全心濕質(zhì)量,計算心臟系數(shù)(全心濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。(2)心肌組織中GSH的檢測:取心肌約50 mg,置于預冷的PBS中,洗去殘留血液,用濾紙吸干水分,在4℃冰浴中制備10%的心肌組織勻漿,低溫離心3 000 r/min,30 min,取上清比色法檢測GSH。(3)心肌細胞線粒體膜電位檢測:取心臟約50 mg,制成單細胞懸液,調(diào)整細胞數(shù)的濃度為106個/mL。用流式細胞儀檢測,將100 μL細胞懸液(106個/mL)加入5 mL的流式測定管中,同時設(shè)立陰性對照管。在測定管中加入1 μL JC-1工作液,陰性對照管不加。輕輕混勻。將測定管和對照管置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15~20 min;吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測定管和對照管中,上機檢測。流式細胞儀激發(fā)波為488 nm,紅色熒光的最大發(fā)射波長為580/590 nm,綠色熒光的最大發(fā)射波長為510/527 nm,以紅/綠熒光強度比值代表細胞線粒體膜電位,圖像采用Cell Quest軟件分析。

    1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,以均數(shù)±標準差±s)表示,方差不齊時采用秩和檢驗,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 心臟系數(shù)結(jié)果 各組分別與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與正常對照組比較,黃芪注射液小劑量組心臟系數(shù)偏大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與黃芪注射液大劑量組、中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

    2.2 心肌組織中GSH檢測結(jié)果 各組分別與阿霉素模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);黃芪注射液各劑量組相互比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

    2.3 線粒體膜電位 阿霉素模型組與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);黃芪注射液各劑量組與正常對照組比較,差異也有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),見表3。

    表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s)

    表1 黃芪注射液對ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s)

    **P<0.01

    正常對照組(1)阿霉素模型組(2)黃芪大劑量組(3)黃芪中劑量組(4)黃芪小劑量組(5)F 12 10 12 12 12 4.11±0.10 4.44±0.14 4.18±0.13 4.21±0.16 4.24±0.18 7.140**組比(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(1)∶(5)(2)∶(3)P<0.001 0.193 0.104 0.036<0.001組比(2)∶(4)(2)∶(5)(3)∶(4)(3)∶(5)(4)∶(5)P<0.001 0.003 0.624 0.411 0.738統(tǒng)計學處理組別 n 心臟系數(shù)(mg/g)

    表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s)

    表2 黃芪注射液對ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s)

    **P<0.01

    正常對照組(1)阿霉素模型組(2)黃芪大劑量組(3)黃芪中劑量組(4)黃芪小劑量組(5)F 12 10 12 12 12 3.99±0.47 2.02±0.22 2.77±0.16 2.88±0.56 2.67±0.28 36.118**組比(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(1)∶(5)(2)∶(3)P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001組比(2)∶(4)(2)∶(5)(3)∶(4)(3)∶(5)(4)∶(5)P<0.001<0.001 0.609 0.550 0.270統(tǒng)計學處理組別 n GSH(mg/g)

    表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s)

    表3 黃芪注射液對ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s)

    **P<0.01

    正常對照組(1)阿霉素模型組(2)黃芪大劑量組(3)黃芪中劑量組(4)黃芪小劑量組(5)F 12 10 12 12 12 1.86±0.22 0.88±0.27 1.43±0.16 1.33±0.18 1.07±0.14 40.523**組比(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(1)∶(5)(2)∶(3)P<0.001<0.001<0.001<0.001 0.027組比(2)∶(4)(2)∶(5)(3)∶(4)(3)∶(5)(4)∶(5)P 0.001<0.001 0.002<0.001 0.211統(tǒng)計學處理組別 n線粒體膜電位(FL2/FL1)

    3 討論

    心肌細胞凋亡可直接導致心臟動力來源減少,凋亡細胞局部纖維化可誘發(fā)心律失常。線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential)紊亂是細胞凋亡時發(fā)生的細胞內(nèi)事件之一,是細胞凋亡過程中的重要事件,其可導致在線粒體膜上形成孔洞,細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中。線粒體內(nèi)容物釋放的調(diào)控被認為與線粒體膜上一種稱為permeability transition pore(PT pore)的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔有關(guān),此孔道打開會造成線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失、線粒體膜電位下降,造成線粒體漲大,外膜漲破之后細胞色素C釋放到細胞液中引起細胞凋亡[3]。線粒體膜電位下降是細胞凋亡的特征性標志,維持正常的線粒體膜電位是抑制細胞凋亡的重要手段[4]。本研究選用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1),它是一種以JC-1為熒光探針,快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(ma?trix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時JC-1為單體(monomer),可以產(chǎn)生綠色熒光,這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。紅綠熒光的相對比例常用來衡量線粒體膜電位。本研究結(jié)果顯示,黃芪注射液能穩(wěn)定心肌細胞膜電位,抑制膜電位下降,減緩心肌細胞凋亡。

    線粒體是能量產(chǎn)生的重要場所,在產(chǎn)生能量的同時也會產(chǎn)生大量的氧自由基(ROS),ROS過多會造成線粒體損傷、膜電位下降、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放和細胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放[3]。GSH參與體內(nèi)氧化還原過程,能和過氧化物及自由基結(jié)合,以對抗氧化劑對巰基的破壞,保護細胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞,同時還可對抗自由基對重要臟器的損害,是人體組織中用于清除ROS的抗氧化劑。GSH不僅參與細胞抗氧化反應、維持機體的氧化還原平衡,還參與了調(diào)節(jié)細胞增生、機體免疫應答。GSH降低是潛在的凋亡早期激活信號,隨后產(chǎn)生的ROS促使細胞發(fā)生凋亡,即細胞發(fā)生凋亡時,細胞漿內(nèi)的GSH水平會降低[5],因此檢測GSH水平可以判斷和檢測細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示黃芪注射液可提高ADR小鼠細胞漿內(nèi)GSH,保護心肌細胞,抑制細胞凋亡。

    [1]Haeberlein SL.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death[J].Neurochem Res,2004,29(3):521-530.

    [2]李曉東,徐建良,姜楠,等.內(nèi)毒素對大鼠肝細胞線粒體膜電位的影響及黃芪注射液的干預作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2005,15(6):357-358.

    [3]Correa F,Soto V,Zazueta C.Mitochondrial permeability transition rel?evance for apoptotic triggering in the post-ischemic heart[J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(4):787-798.

    [4]陳楠楠,劉春雨,黃世林,等.線粒體膜電位在PUVA誘導HL-60,K562細胞凋亡時的變化[J].中藥材,2008,31(11):1679-1681.

    [5]高世勇,徐麗麗,季宇彬.龍葵堿調(diào)控還原型谷胱甘肽和活性氧氧化還原體系損傷線粒體超微結(jié)構(gòu)誘導HepG2細胞凋亡[J].中草藥,2009,40(11):1779-1784.

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