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    雙向電泳分析葉酸對神經(jīng)干細胞蛋白表達的影響*

    2011-07-16 02:53:18黃國偉
    天津醫(yī)藥 2011年7期
    關(guān)鍵詞:雙向電泳葉酸組學

    劉 歡 黃國偉 何 冰 楊 陽 趙 琳

    神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的未分化細胞[1]。葉酸對于細胞分裂和組織生長具有極其重要的作用。研究證實在胚胎發(fā)育早期,補充葉酸能夠有效預(yù)防神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTDs),其作用機制可能是葉酸激活神經(jīng)系統(tǒng)的生長和分化[2]。NSCs是當今研究熱點之一,在蛋白質(zhì)組學中,神經(jīng)蛋白質(zhì)組學也被認為是最具潛力的研究熱點[3-4]。雙向凝膠電泳是根據(jù)等電點和分子質(zhì)量對蛋白質(zhì)進行分離的方法[5],是蛋白質(zhì)組學研究中應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。本研究旨在通過雙向電泳(2-DE)方法深入研究葉酸對NSCs增殖分化的作用機制,為探討葉酸防治神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 清潔級孕Sprague-Dawley(SD)大鼠,14~16 d,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

    1.1.2 試劑與儀器 DMEM2429無葉酸培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液、神經(jīng)細胞培養(yǎng)添加劑B27購于Invitrogen公司;固相pH梯度干膠條(IPG DryStrip,Ph3-10NL)、尿素、硫脲、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、氨基丁三醇(Tris)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、甲叉雙丙烯酰胺、碘乙酰胺、四甲基二乙胺(TEMED)、溴酚藍、過硫酸胺(APS)、甘氨酸(Glycine)、丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)(Bio?lyte3-10)、礦物油、等電聚焦儀(Protein IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(ProteinⅡ xi Cell)、CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)及PD?Quest8.0D凝膠圖像分析軟件均為Bio-Rad公司產(chǎn)品;Benzo?nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制劑購于Merck公司;5′-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、甘油、溴酚藍、低熔點瓊脂糖均為Sigma公司產(chǎn)品;人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)為Perotech公司產(chǎn)品;兔抗大鼠巢蛋白(nestin)一抗、小鼠抗大鼠BrdU一抗為Santa Crus公司產(chǎn)品;羊抗兔TRITC熒光二抗、山羊抗小鼠FITC熒光二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司;銀染試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 NSCs的培養(yǎng)和分組 (1)按照文獻[6]方法進行NSCs原代培養(yǎng),取胎鼠腦皮質(zhì),剝除腦膜和血管,用培養(yǎng)液沖洗3次,將其剪碎成0.5 mm3,移入DMEM培養(yǎng)液中,吹打數(shù)次,制成單細胞懸液,過200目尼龍篩網(wǎng),1 000 r/min離心10 min,去上清,加入NSCs培養(yǎng)液,即DMEM 2429無葉酸培養(yǎng)液(葉酸濃度為0.6 mg/L)與F12培養(yǎng)液按1∶1混合,含B27添加劑2%,上皮生長因子(EGF)20 μg/L,bFGF 20 μg/L,L-谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素和鏈霉素100 U/mL,將細胞接種于培養(yǎng)瓶。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,隔天換液。(2)細胞共分為3組:對照(Control)組葉酸終濃度為4 mg/L;葉酸缺乏(Folate-D)組葉酸濃度為0.6 mg/L;葉酸補充(Folate-L)組葉酸終濃度為8 mg/L。

    1.2.2 NSCs的鑒定 增殖第4天,加入終濃度10 mg/L BrdU繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再將NSCs種植于預(yù)先置有多聚賴氨酸涂布蓋玻片的24孔培養(yǎng)板,并加入含有血清的培養(yǎng)基(DMEM,10%胎牛血清),添加B272%,EGF 20 μg/L,bFGF 20 μg/L,L-谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素和鏈霉素100 U/mL。培養(yǎng)4 h后,Nes?tin和BrdU抗體進行細胞免疫組織化學染色[6],共聚焦顯微鏡下觀察NSCs免疫熒光雙標記表達情況。

    1.2.3 細胞全蛋白的提取和定量 培養(yǎng)6 d后,收集細胞,加入PBS,1 500 r/min離心10 min,棄上清。重復3次。加入4~5倍體積裂解液,混勻(裂解液成分:7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.2%Bio-Lyte3-10、200 U/mL Benzo?nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制劑)。液氮中反復凍融3次,每次3 min。加入200 U核酸酶抑制劑,4℃放置15 min。15 000 r/min,4 ℃離心40 min,收集上清,Bradford法對裂解后NSCs蛋白質(zhì)樣品進行定量。

    1.2.4 雙向電泳 參考文獻[7],每組樣品重復3次。將樣品和水化液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS,65 mmol/L DTT,0.2%Bio-Lyte,痕量溴酚藍)混合,總體積400 μL(蛋白上樣量500 μg),常溫被動溶脹上樣15 h。等電聚焦程序參數(shù)按如下建立:250 V 1 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,5 000 V 3 h,10 000 V,至總伏特·小時(V·h)達到80 000。將聚焦后的膠條在SDS平衡液(6 mol/L 尿素,0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,20%甘油,2%SDS)中平衡2次,搖床上振蕩15 min,2次,其中第1次平衡液中加入20 mmol/L的DTT,第2次平衡液中加入100 mmol/L碘乙酰胺。將平衡后的IPG膠條進行垂直SDS-PAGE第2相電泳,恒流12 mA 30 min,之后30 mA直至溴酚藍前沿到達膠底線。所得凝膠參考文獻[7]方法進行硝酸銀染色。

    1.2.5 凝膠圖像分析 采用CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)對染色后的2-DE膠進行掃描,PDQuest8.0凝膠圖像分析軟件進行分析,對同一組標本的3個凝膠圖,選取一張點數(shù)最多,條紋最少的作為參考膠,與另外2個凝膠圖進行匹配,建立該組平均凝膠圖,參照平均凝膠圖進行蛋白斑點檢測,蛋白的相對表達量用掃描積分光密度值表示,2組間表達量升高或降低2倍者定義為差異蛋白點。

    2 結(jié)果

    2.1 NSCs的鑒定 培養(yǎng)2~3 d后,可見大小不等的細胞團,較大的細胞團由數(shù)十個細胞組成,細胞邊緣發(fā)亮,折光性強,呈懸浮狀態(tài),即為神經(jīng)球;隨著培養(yǎng)時間的延長,神經(jīng)球逐漸增大,原代培養(yǎng)至第7天,可形成數(shù)百個細胞集落,此時細胞排列緊湊,呈桑葚狀。培養(yǎng)的細胞經(jīng)免疫熒光雙標記染色后,于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞球內(nèi)的細胞顯示紅色熒光,細胞核綠色熒光表明BrdU陽性,見圖1。

    2.2 雙向電泳凝膠分離結(jié)果 經(jīng)圖像分析,在pH 3~10區(qū)域,每塊凝膠可分辨874±21(n=3)個蛋白點,軟件分析結(jié)果見圖2,各組凝膠蛋白點匹配率達88.5%,見圖3。

    圖2 蛋白點計數(shù)軟件圖

    圖3 各組NSC雙向電泳凝膠圖譜

    2.3 差異蛋白分析結(jié)果 在pH 3~10的圖譜中,F(xiàn)o?late-D組較Control組出現(xiàn)差異蛋白點6個,其中2個蛋白點表達量降低,4個蛋白表達量升高;Folate-L組較Control組出現(xiàn)差異蛋白點3個,其中2個蛋白點表達量降低,1個蛋白表達量升高。

    3 討論

    2-DE是蛋白質(zhì)組學研究中的基礎(chǔ)技術(shù),把高分辨率的等電聚焦和SDS-PAGE電泳結(jié)合在一起,其分離效果遠遠高于傳統(tǒng)的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,成為用于復雜蛋白樣品分離的首選方法。

    NSCs研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學研究的重要領(lǐng)域。神經(jīng)系統(tǒng)中多能干細胞的分離、培養(yǎng)成功,不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生理論提出了挑戰(zhàn),而且對于研究腦的發(fā)育、分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療均具有重要意義。本研究在調(diào)整了雙向電泳中的幾個關(guān)鍵因素后,獲得了分辨率高、重復性好的NSCs電泳圖[7]。

    腦損傷后神經(jīng)元再生的機制復雜,特別是如何控制NSCs定向分化和遷移仍是尚未解決的問題。有研究顯示,葉酸缺乏與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),如阿爾茨海默病、認知損傷等,但與神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系和機制尚不完全清楚[8]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn),葉酸可促進NSCs的增殖[6];動物實驗顯示,葉酸能降低腦缺血大鼠血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平,增強腦缺血大鼠學習記憶能力,改善神經(jīng)功能[9]。蛋白質(zhì)組學有助于進一步發(fā)現(xiàn)葉酸通過哪些蛋白促進NSCs的增殖分化。由于NSCs樣本的獲得成本較高,在實驗方法上,筆者對NSCs的2-DE條件進行了的摸索,在上樣量、等電聚焦條件、樣品裂解液、上樣緩沖液的成分選擇等方面進行了優(yōu)化,提高了分析的準確性。本研究顯示葉酸缺乏和葉酸補充均會影響NSCs的蛋白表達,與Control組比較共發(fā)現(xiàn)差異蛋白點9個,這些蛋白可能與NSCs增殖分化有密切關(guān)系,其分子質(zhì)量和等電點等信息通過雙向電泳圖獲得了初步確定,還需要進一步進行質(zhì)譜鑒定、氨基酸序列分析和數(shù)據(jù)庫的檢索以確認為何種蛋白,而這些蛋白在NSCs增殖分化中的具體作用則有待更深入的功能生物學研究。

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