癌基因H-ras啟動(dòng)子區(qū)重新甲基化抑制胃癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究

袁 夢(mèng) ，羅 瑾 ，李燕妮 ，耿 鑫 ，張維銘

（1.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，天津300041）

表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變并且可以通過細(xì)胞有絲分裂或減數(shù)分裂傳代的基因功能（表達(dá)）改變的學(xué)科，包括DNA甲基化、組蛋白乙?；旧|(zhì)重塑和RNA干擾等。其中DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)重要的分子機(jī)制之一越來越受到人們的關(guān)注[1-2]。腫瘤的發(fā)生與基因組和表觀遺傳的改變有著很大的聯(lián)系。DNA甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控中一種常見而又重要的機(jī)制，基因組正常甲基化模式的改變與各類腫瘤的演變發(fā)展有著密切的聯(lián)系[3-4]。高甲基化可以抑制腫瘤抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄，從而使抑癌基因沉默；而低甲基化會(huì)增加基因組的不穩(wěn)定性，誘導(dǎo)癌基因和腫瘤相關(guān)基因的激活，是引起腫瘤發(fā)生的原因之一。本研究通過使用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine,SAM）處理人胃癌細(xì)胞系MGC-803和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1，以觀察SAM對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞生長的生物學(xué)影響，并研究癌基因H-ras啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變及相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況，以期在腫瘤的臨床診斷和藥物治療中探討出新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞系MGC-803由天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科研究所饋贈(zèng)，人正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1購自北京腫瘤醫(yī)院遺傳室。

1.1.2 試劑 SAM和Wizard DNA Clean-up System（美國Promega公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（HyClone公司）；基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）；DNA聚合酶（TaKaRa公司）；細(xì)胞免疫熒光染色試劑（北京中山金橋生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 MGC-803細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，GES-1細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL的DMEM低糖培養(yǎng)基中，傳代24 h后，隨機(jī)選取兩個(gè)細(xì)胞系中的部分細(xì)胞，向細(xì)胞中加入SAM，使其終濃度為10 μmol/L，作為實(shí)驗(yàn)組，記為 T1(MGC-803藥物處理組)和T2（GES-1藥物處理組）；未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分別記為C1（MGC-803對(duì)照組）和C2（GES-1對(duì)照組），繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，接種7板。每日取1板,加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育 4 h 后棄上清，再加入DMSO 150 μL，于微型振蕩器上振蕩10 min后，在570 nm酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度A值，繪制細(xì)胞生長曲線圖并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，按照公式：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 甲基特異性PCR 應(yīng)用DNA提取試劑盒抽提各組細(xì)胞的基因組DNA。用新鮮配制的氫醌（10 mmol/L）30 μL 和亞硫酸氫鈉（3 mol/L）520 μL水浴脫氨18 h，Wizard DNA Clean-up system過濾柱純化,無水乙醇沉淀，溶解于30 μL去離子水中。以此為模板,分別用甲基化和非甲基化引物擴(kuò)增H-ras啟動(dòng)子序列（引物序列見表1）。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

表1 MSP引物序列Tab 1 The primer sequence of MSP

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 將各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后,傳代于24孔板，每組2孔，記為H-ras。繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，經(jīng)過固定、阻斷各種內(nèi)源性過氧化物酶活性、打孔、封閉等步驟后在H-ras孔中加入兔抗人H-ras單克隆抗體（1∶100稀釋），每孔 300 μL，4℃過夜后，PBS沖洗 3次，在各組的H-ras孔內(nèi)加入TRITC標(biāo)記（紅色熒光）的羊抗兔二抗，每孔1 mL，室溫避光反應(yīng)2 h，棄去二抗，PBS沖洗3次，再加入1 mL PBS，在200倍普通光鏡下計(jì)數(shù)每視野細(xì)胞總數(shù)，熒光下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，3視野/孔，求平均值,計(jì)算著色細(xì)胞陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,對(duì)所得的數(shù)據(jù)采用方差分析和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAM對(duì)細(xì)胞生長的影響 人胃癌細(xì)胞中，加入SAM的處理組T1與未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組C1相比，細(xì)胞的生長增殖活性受到明顯抑制；而人正常胃黏膜上皮細(xì)胞，處理組T2與對(duì)照組C2的細(xì)胞生長情況無明顯差異（圖1、2）。胃癌細(xì)胞MGC-803的生長抑制率為22.0%，而正常細(xì)胞的生長抑制率為6.8%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 胃癌細(xì)胞MGC-803生長曲線圖Fig 1 The growth curve of gastric cancer cells MGC-803 by MTT assay

圖2 正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1生長曲線圖Fig 2 The growth curve of human normal gastric mucosa epithelial cells by MTT assay

2.2 MSP檢測(cè)癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài) 人胃癌細(xì)胞中，癌基因H-ras啟動(dòng)子區(qū)處于非甲基化狀態(tài)，經(jīng)過SAM處理后實(shí)驗(yàn)組中癌基因的啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)；正常細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的H-ras啟動(dòng)子區(qū)均表現(xiàn)為高甲基化（圖3）。

圖3 MSP擴(kuò)增H-ras啟動(dòng)子的電泳圖Fig 3 The electropherogram of H-ras promoter by MSP

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)癌基因蛋白的表達(dá) HRAS蛋白主要表達(dá)于未經(jīng)SAM處理的胃癌細(xì)胞中，陽性信號(hào)多集中在胞漿中，H-RAS蛋白表現(xiàn)為紅色熒光，而正常細(xì)胞系和經(jīng)過藥物處理的胃癌細(xì)胞系幾乎不著色（圖4），著色細(xì)胞陽性率見表2。未經(jīng)SAM處理的實(shí)驗(yàn)組中，H-RAS在正常細(xì)胞組C2的著色細(xì)胞陽性率明顯低于胃癌MGC-803細(xì)胞組C1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng) SAM 處理的胃癌細(xì)胞MGC-803中H-RAS的陽性率與對(duì)照組相比顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)于正常細(xì)胞（T2，C2），藥物處理所引起的H-RAS細(xì)胞陽性率變化均不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 H-RAS蛋白免疫熒光染色圖Fig 4 Expression of H-RAS protein by cell immunofluorescence assay

表2 H-RAS蛋白免疫熒光染色法所得著色細(xì)胞陽性率Tab 2 The cell positive of H-RAS from cell immunofluorescence

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球腫瘤發(fā)病和癌癥死亡率的第二位。原癌基因H-ras突變與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Ras癌基因由K-ras、H-ras和N-ras家族組成，是膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，其作用是在細(xì)胞生長以及代謝過程中將表皮生長因子和胰島素的刺激信號(hào)傳入相應(yīng)的靶細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)的磷脂酶C結(jié)合，從而啟動(dòng)腫瘤發(fā)生。目前已在包括胃癌、大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中證實(shí)了Ras基因的異常改變[5]。

DNA甲基化是真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，許多研究已經(jīng)證明癌基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化和抑癌基因的高甲基化是誘發(fā)細(xì)胞癌變的重要方式[6-8]。Tao等[9]研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)致癌物誘發(fā)大鼠肝癌結(jié)節(jié)中 raf、c-myc、c-fos、c-H-ras、c-K-ras基因啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化，且與其蛋白表達(dá)升高相關(guān)。另外，在上皮性腫瘤乳腺癌、腎細(xì)胞癌和卵巢癌中，癌基因RHOA啟動(dòng)子區(qū)低甲基化且轉(zhuǎn)錄活化，表達(dá)增高[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中癌基因c-myc啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化而高表達(dá)，而抑癌基因p16啟動(dòng)子區(qū)呈異常高甲基化狀態(tài)[11]。本次實(shí)驗(yàn)筆者觀察了胃癌細(xì)胞MGC-803中H-ras基因的表達(dá)情況，正常細(xì)胞系中癌基因H-ras表現(xiàn)出高甲基化，而胃癌細(xì)胞系癌基因H-ras則表現(xiàn)出非甲基化狀態(tài)，經(jīng)過SAM藥物處理后胃癌細(xì)胞系則呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)。此外，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示胃癌細(xì)胞MGC-803在SAM處理后H-RAS蛋白的表達(dá)也顯著降低，表明SAM逆轉(zhuǎn)了基因的低甲基化狀態(tài)，同時(shí)下調(diào)了癌基因及其蛋白的表達(dá)。這與Zhao等[12]的結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)在給予不同濃度SAM（0、2、4 mmol/L）處理胃癌細(xì)胞后，癌基因cmyc啟動(dòng)子區(qū)域低水平甲基化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，重新處于甲基化狀態(tài)，同時(shí)相應(yīng)蛋白表達(dá)量也明顯下降。進(jìn)一步證明了H-ras的致癌作用是可逆的，處于低甲基化狀態(tài)的癌基因可以重新獲得甲基而失去其原有的惡性增殖的特性，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)展。

SAM是生物體內(nèi)除甲硫氨酸（蛋氨酸）本身甲基化外所有甲基化反應(yīng)的甲基供體，許多研究利用SAM來抑制癌基因低甲基化，增加DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性[13]。Pouya等[14]以SAM誘導(dǎo)乳腺癌尿激酶（uPA）重新甲基化，發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)低甲基化狀態(tài)，抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，資料表明SAM對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制呈時(shí)間和劑量依賴性[12]。本實(shí)驗(yàn)用SAM處理胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞，在MTT實(shí)驗(yàn)中通過繪制生長曲線圖可以觀察到，給予SAM處理后胃癌細(xì)胞MGC-803生長增殖情況較對(duì)照組受到明顯的抑制，而正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的生長情況卻沒有明顯差異。這表明SAM可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長而不影響正常細(xì)胞的生長狀態(tài)，有望應(yīng)用于臨床治療，從而降低藥物對(duì)患者正常組織的損傷。然而，值得注意的是在癌癥發(fā)生的早期階段，抑癌基因還沒有完全沉默，給予SAM使癌基因重新甲基化的同時(shí)可能導(dǎo)致腫瘤抑癌基因的高甲基化[14]。這引發(fā)了進(jìn)一步的思考，如何調(diào)整SAM的濃度和劑量來實(shí)現(xiàn)癌基因的重新甲基化同時(shí)又不抑制抑癌基因的活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了新的方向。

綜上所述，通過檢測(cè)H-ras重新甲基化后細(xì)胞生長狀況以及基因和蛋白的表達(dá)，可以得出癌基因啟動(dòng)子區(qū)域重新甲基化能夠逆轉(zhuǎn)癌基因的低甲基化狀態(tài)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長的結(jié)論，同時(shí)也為降低胃癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移性的臨床治療研究提供新的思路。

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