HPLC法測(cè)定血漿中辛伐他汀濃度

劉 晶 ，朱立勤 ，孫秀娟

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市第一中心醫(yī)院藥劑科，天津300192；3.天津市民政局老年病醫(yī)院，天津300110）

辛伐他汀為臨床常用治療高脂血癥的藥物，對(duì)膽固醇有抑制作用，臨床主要用于治療原發(fā)性高膽固醇血癥[1]。由于辛伐他汀為前體藥物，在血中含量較低，因此其血藥濃度測(cè)定較為困難。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定，簡(jiǎn)便靈敏，用于臨床上辛伐他汀血藥物濃度監(jiān)測(cè)，取得良好效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 島津LC-10AVP高效液相色譜儀（LC-10AVP輸液泵，SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，ANASTAR色譜工作站）；AR2140型電子分析天平；色譜分析柱 Kromasil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm，天津市琛航科學(xué)儀器有限公司）；辛伐他汀片（浙江海正藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：091208，20 mg/片）；辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：090402）；內(nèi)標(biāo)物洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：090402）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。血漿樣品由天津市第一中心醫(yī)院提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（60∶40）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；靈敏度：0.002(AUFS)；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 辛伐他汀儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加甲醇溶解稀釋于50 mL容量瓶中搖勻，再精密吸取此溶液10 mL，加甲醇溶解并稀釋于50 mL容量瓶中，制備成40 μg/mL的辛伐他汀儲(chǔ)備液。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)液配制 精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物洛伐他汀10.0 mg，加乙腈溶解并稀釋于100 mL的容量瓶中，搖勻，制成濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。再精密吸取此溶液0.2 mL，加乙腈溶解并稀釋于100 mL的容量瓶中，制備成200 ng/mL的內(nèi)標(biāo)供試液。

1.2.4 血樣處理 取標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液0.5 mL，置于旋渦混合器上混勻5 min，用高速離心機(jī)（13000 r/min）離心5 min，取出上清液,置于60℃水浴上用氮?dú)獯蹈?，?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶后，高速離心，取上清液20 μL待測(cè)。

1.2.5 辛伐他汀血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取空白血漿500 μL，置于具塞刻度試管中，精密加入辛伐他汀儲(chǔ)備液(40 μg/mL)適量，再精密加入內(nèi)標(biāo)供試液 500 μL，分別制成濃度為 5、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液。按血樣處理方法操作以不同濃度辛伐他汀系列溶液的辛伐他汀峰面積（As）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）來(lái)計(jì)算Y（Y=As/Ai），以Y值為縱坐標(biāo)，辛伐他汀濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀色譜圖 分別將空白血漿和辛伐他汀血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液按血樣處理方法操作后進(jìn)樣，得出色譜圖。血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響辛伐他汀與內(nèi)標(biāo)的分離測(cè)定，辛伐他汀與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為8.9 min和6.7 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 血漿中辛伐他汀色譜圖A空白血漿，B辛伐他汀血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液；1.內(nèi)標(biāo)物洛伐他汀 2.辛伐他汀

2.2 辛伐他汀血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線 辛伐他汀在5～1000 ng/mL范圍內(nèi)，血藥濃度與峰面積比有良好線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.0046C+0.122，r=0.9997。以信噪比S/N=3∶1計(jì)，辛伐他汀最低檢測(cè)濃度為2 ng/mL。

2.3 回收率及精密度 將10、100、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液按血樣處理方法項(xiàng)下操作，分別進(jìn)樣5次，將辛伐他汀峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）之比Y代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辛伐他汀血漿濃度，以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算方法回收率。以1 d內(nèi)測(cè)得的辛伐他汀濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)5次測(cè)定的辛伐他汀濃度計(jì)算日間精密度，見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度

3 討論

3.1 預(yù)處理方法選擇 目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道血漿樣品預(yù)處理的方法多采用萃取法和沉淀法。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試用萃取法進(jìn)行血漿樣品的預(yù)處理，使用含5%異丙醇的二氯甲烷等多種試劑進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)萃取操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，得出的色譜峰雜質(zhì)較多，提取量與濃度之間線性不理想，二氯甲烷等有機(jī)溶劑毒性較大。因此本文采取沉淀法完成樣品預(yù)處理。文獻(xiàn)報(bào)告的沉淀法對(duì)儀器要求較高[2]，血樣反復(fù)用乙腈沉淀蛋白，處理過(guò)程復(fù)雜，結(jié)果準(zhǔn)確性差，不能滿足本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)對(duì)沉淀法進(jìn)行了改進(jìn)，用乙腈沉淀蛋白吹干、復(fù)溶再進(jìn)行色譜分析，操作過(guò)程簡(jiǎn)便快速，提高了準(zhǔn)確性和精密度。

3.2 沉淀試劑的選擇 一般血樣處理中沉淀蛋白常用試劑為甲醇和乙腈[3-4]，本實(shí)驗(yàn)在篩選條件時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)選擇了甲醇、乙腈分別作為沉淀試劑，結(jié)果乙腈較前者的沉淀效果更為完全，雜質(zhì)峰較少，因此本實(shí)驗(yàn)選用乙腈用作蛋白沉淀劑。

3.3 流動(dòng)相篩選 實(shí)驗(yàn)中選擇了多種流動(dòng)相體系，包括不同比例的甲醇∶水、甲醇∶乙腈∶水、乙腈∶水等作為流動(dòng)相來(lái)篩選實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與甲醇相比，乙腈的洗脫能力強(qiáng)，以60∶40的乙腈∶水作為流動(dòng)相，可以滿足色譜系統(tǒng)檢測(cè)的要求，并且系統(tǒng)分離效果較好，峰形對(duì)稱(chēng)，柱效高，保留時(shí)間適宜。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈∶水（60∶40）作為流動(dòng)相。

近年來(lái)他汀類(lèi)藥物在心血管疾病的治療方面起到非常重要的作用，其中辛伐他汀是此類(lèi)藥物中使用較為廣泛的一種。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相的方法測(cè)定辛伐他汀血漿濃度，方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、回收率高、精密度好，可滿足臨床血藥濃度測(cè)定的需要。

［1］Wang D,Qin F,Chen L,et al.Determination of lovastatin in human plasma by ultra-performance liquid chromatography eLectrospray ionization tandem mass spectrometry[J].BiomedChromatogr，2008，22(5)：511

［2］申屠建中，章霞，陳志根，等.固相萃取反相高效液相色譜法檢測(cè)人血漿中辛伐他汀濃度[J].藥物分析雜志，2002，22(1)：18

［3］王東，秦峰，陳凌云，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中的辛伐他汀[J].色譜，2008,26（3）:327

［4］張紅，徐文煒，胡曉，等.人血漿中辛伐他汀的HPLC-MS/MS測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（12）:833