序貫法測定原位凝膠材料OALA的LD50

顧 娜，李 旭，鄧聯(lián)東，梁艷琴，王偉偉，胡人杰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020；3.天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，天津300073）

原位凝膠是一種新型的具有控釋作用的藥物制劑材料[1]。與傳統(tǒng)的給藥系統(tǒng)相比，原位凝膠有著顯著的優(yōu)點。OALA屬于聚酸酐類原位凝膠材料，系由天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院研發(fā)的一種可生物降解高分子材料，由于其具有良好的表面溶蝕降解性[3]、生物相容性、結(jié)構(gòu)易改性、降解速率可調(diào)及易加工性等優(yōu)異性能，有望成為新型藥用輔料而在醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域得到應(yīng)用。本項研究通過OALA血管內(nèi)給藥對其使用安全性進行評價，為其深入的生物學(xué)及藥學(xué)實驗研究設(shè)計提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥 原位凝膠材料OALA：為白色片狀粉末，由天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院提供。

1.1.2 實驗動物 KM種小鼠，Ⅱ級實驗動物，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究中心提供，合格證號：sxck(京)2006-0008。標準化Ⅱ級動物實驗室，IVC屏障系統(tǒng)，使用許可證號：SYXK（津）2005-0001。普通全價顆粒飼料Ⅱ號，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，京動許字（2000）第015號，動物飲用純凈水。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥劑量設(shè)計 采用序貫法[2-5]等體積給藥（即給藥體積相等，通過改變?nèi)芤核幬餄舛日{(diào)整給藥劑量）和等濃度給藥（即給藥溶液濃度不變，通過改變給藥體積調(diào)整給藥劑量）給藥方案。經(jīng)預(yù)實驗確定動物存活率為100%與0的劑量，劑量間距設(shè)計為 1∶0.87。前者設(shè)計給藥濃度為 10、8.7、7.6、6.6、5.7、5mg/mL（給藥體積為0.4mL/20 g體重），后者設(shè)計給藥體積為 0.64、0.51、0.40、0.32、0.25、0.20mL（設(shè)計濃度為7.53mg/mL）。

1.2.2 實驗數(shù)據(jù)的采集 按從高劑量至低劑量的順序進行靜脈注射，注射后觀察10min，若動物出現(xiàn)死亡則降低一劑量組給藥，若動物存活則提高一劑量組給藥，直至按照要求實驗過程中出現(xiàn)5~6個“不死波谷”的周期劑量；對實驗存活動物描述其相關(guān)活動；對死亡動物進行常規(guī)病理解剖，摘取心臟、肺臟、肝臟、腎臟及腦組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，組織病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3 LD50的計算 按照下述公式∶

X0為實驗第一次出現(xiàn)陽性（即存活）為中心組的劑量值，N為各實驗組出現(xiàn)陽性數(shù)的總和，A為各組陽性數(shù)與組序之積再求和，B為各組陽性數(shù)與組序平方之積再求和，i為劑量對數(shù)的公差項

2 結(jié)果

2.1 實驗動物反應(yīng)情況 致死劑量OALA注射后動物會即刻出現(xiàn)死亡，死亡均出現(xiàn)于給藥后1min之內(nèi)，死亡前動物偶見排便現(xiàn)象。注射存活劑量后，動物出現(xiàn)豎毛、臥伏不動、身體傾斜、眼閉，嚴重者出現(xiàn)抽搐、跳躍等現(xiàn)象，4 h后恢復(fù)常態(tài)，繼續(xù)觀察1周，動物未見異常。

實驗操作依據(jù)：劑量對數(shù)值之差（i）以4~6組可包括0%和100%死亡率為宜，第一次變號的前一次作為實驗開始。具體實驗結(jié)果詳見圖1和圖2。

圖1根據(jù)計算公式，LD50=7.53mg/mL（給藥體積為 0.4mL/20 g體重）；Sm=0.017；95%可信限為7.53±0.576。

圖2根據(jù)計算公式，LD50=0.31mL（給藥濃度為7.53mg/mL）；Sm=0.081；95%可信限為 0.31±0.113。

最終計算兩種給藥方法小鼠靜脈注射給藥的LD50分別為150.6mg/kg和116.7mg/kg。

2.2 組織病理學(xué)觀察 病理組織觀察結(jié)果顯示，小鼠肺組織各級靜脈擴張瘀血，血管腔可見藍灰色細顆粒狀材料，見圖3，其它組織器官未見病理組織學(xué)改變。通過動物死亡時的表現(xiàn)以及組織病理學(xué)的觀察可以認為動物的死亡原因系由于急性、彌漫性肺栓塞所致。

3 討論

LD50的測定系評價生物樣品安全性的重要技術(shù)指標，其測定方法主要包括Bliss機率單位法、簡化機率單位法、寇氏法、目測圖示法、綜合計算法[2-5]等。與上述方法相比較，本實驗所采取的序貫法特別適用于可迅速致死的樣品的測定且簡便易行，節(jié)省動物。預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)測試樣品OALA靜脈注射可致動物迅速死亡，故而在實驗中采用本方法。

實驗樣品OALA是一種新型的、用作藥物載體的溫敏型納米凝膠材料，該材料在體內(nèi)、外具有條件成膠的特性，即在一定的濃度（25%，W/W）下，一定的溫度范圍（體溫）內(nèi)形成凝膠。體內(nèi)成膠后OALA將在體液對其不斷的溶蝕作用下將其所載藥物釋出，從而達到控釋、緩釋作用。以往筆者所測定的OALA成膠條件均是由體外（試管內(nèi)）及動物皮下植入所獲得的，血管內(nèi)途徑測試該樣品為首次。由實驗結(jié)果可以看出，盡管測定LD50時筆者給入的樣品配制的濃度（1%）遠遠低于體外（體內(nèi)動物皮下）成膠的濃度，但是在小血管和微循環(huán)中OALA作為“凝膠的性質(zhì)”仍然保留，即便濃度很低仍可成膠。這一現(xiàn)象是否提示體內(nèi)成膠濃度可低于體外成膠濃度，有待進一步證實。

另外，由于OALA成膠與濃度具有明確的關(guān)系，即濃度越低越不容易成膠，在血管內(nèi)也是如此，本實驗結(jié)果也證明了這一點，當(dāng)濃度（給入劑量）低到一定程度將不會造成動物死亡，筆者曾經(jīng)嘗試不改變（致死）劑量而將給藥體積增加一倍，則可使“毒性”大幅度降低，這一結(jié)果也說明了納米凝膠體系與生物體相互作用的復(fù)雜性，而這種復(fù)雜性是由這種新型制劑的特性所決定，也正是考慮到這種復(fù)雜性筆者在實驗中設(shè)計了等體積給藥方案和等濃度給藥方案。由此可見，如果想要綜合評價OALA（或其它凝膠體系）血管內(nèi)給藥的安全性，則還應(yīng)該設(shè)計更多的實驗，更多、更全面地考慮凝膠特性與生物體的復(fù)雜性，才能得到更加可靠的，更加接近實際結(jié)論。

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