紫貽貝配子細胞表面糖基的定位研究

劉慧慧，李太武，蘇秀榕

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211）

紫貽貝Mytilus edulis Linnaeus俗稱青口、海紅，其干制品稱淡菜，有很高的營養(yǎng)價值、藥用和保健功效，是我國目前主要的貝類養(yǎng)殖品種之一，在山東、浙江、廣東等沿海省份都有廣闊的養(yǎng)殖海域。目前對紫貽貝的研究主要集中在組織學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、養(yǎng)殖技術(shù)、分子特征[1]及雜交育種[2]等方面，對其受精機理的研究還未見報道。

在對受精機制的研究中，精子與卵細胞表面的糖蛋白受到了廣泛重視，應(yīng)用凝集素親和細胞化學(xué)方法，在多種動物和人配子細胞表面已證實有糖蛋白分布，另有研究發(fā)現(xiàn)鮑精子頂體泡和卵細胞表面分布大量糖蛋白類物質(zhì)，是否貽貝的配子細胞也具有同樣特征，有待于研究證實。因此，我們選用可以特異性結(jié)合半乳糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖（精卵識別中起重要調(diào)節(jié)作用）的熒光標(biāo)記凝集素，對紫貽貝配子細胞中對應(yīng)的糖進行研究，以期為貽貝生殖機理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

貽貝新鮮的雌雄性腺組織用改良的Carnoy液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度為7 μm）。

1.2 凝集素

本實驗所用FITC標(biāo)記的LCA（兵豆凝集素）、PNA（花生凝集素）、UEA（荊豆凝集素）、和WGA（麥胚凝集素）均購自美國Sigma化學(xué)公司，LCA與α-D甘露糖特異性結(jié)合，PNA特異性結(jié)合α,β-半乳糖，WGA可與葡萄糖特異性識別，UEA則特異性識別巖藻糖，上述幾種凝集素的工作液濃度均為50 μg/mL。

1.3 凝集素細胞化學(xué)

切片按常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇重新增加水，再以蒸餾水沖洗，入0.1 mol/L pH 7.4 PBS（內(nèi)含1%牛血清白蛋白和 0.3%Triton X-100）洗 5 min×3，后轉(zhuǎn)入 PBSC（0.1 mol/L pH 7.2 的 PBS，含 0.1 mmol/L Ca-Cl2、MgCl2和MnCl2）20 min。除去多余液體后用微量注射器加上50 μg/mL FITC-凝集素（用PBSC稀釋），放在潮濕容器內(nèi)，37℃避光孵育0.5 h。PBS洗5 min×3，除去未被結(jié)合的標(biāo)記凝集素，熒光顯微鏡觀察（Olympus熒光顯微鏡，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm），照相。另有部分切片做HE染色以進行結(jié)構(gòu)對照。

1.4 結(jié)果判定

熒光顯微鏡下仔細觀察整個切片的染色情況，根據(jù)組織染色強度不同分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性(++)、強陽性 (+++)。

2 結(jié)果

2.1 紫貽貝卵細胞分布特征及凝集素標(biāo)記

貽貝卵巢是由薄層肌肉和結(jié)締組織將之分割成一個個小區(qū)或稱分枝的管狀結(jié)構(gòu)，管壁由復(fù)層上皮和非細胞結(jié)構(gòu)的基膜構(gòu)成，生殖上皮不斷向腔內(nèi)產(chǎn)生卵原細胞，再由之經(jīng)初、次級卵母細胞、最終發(fā)育為成熟的卵子。當(dāng)卵巢發(fā)育至成熟期時，管腔內(nèi)充滿成熟卵子，由于互相擠壓而表現(xiàn)為不規(guī)則的形狀，在隨之而來的排放期中，腔內(nèi)的成熟卵子明顯減少，多表現(xiàn)為圓形或橢圓形。實驗中所觀察到的紫貽貝卵細胞正處于該期，其糖分布及含量如表1和圖版1所示。在濾泡間隔區(qū)和細胞核區(qū)，甘露糖、半乳糖、巖藻糖、葡萄糖都沒有分布，這4種糖在卵細胞邊緣的標(biāo)記特征亦不明顯，只是半乳糖和葡萄糖在一些卵細胞邊緣有區(qū)域性分布；但在細胞質(zhì)區(qū)，這4種糖均有少量分布。

表1 紫貽貝卵細胞熒光凝集素標(biāo)記強度Tab.1 Reaction of FITC-labeled lectin on eggs of Mytilus edulis

2.2 紫貽貝精子分布特征及凝集素標(biāo)記

紫貽貝的精巢是由無數(shù)的生殖小管纏繞在一起構(gòu)成的，各小管間由薄層肌肉和少量結(jié)締組織隔開。到了生殖高峰期，輸精小管內(nèi)充滿精子，僅在輸精小管邊緣有少量的精原細胞、精母細胞、精細胞按照由外向內(nèi)逐級呈輻射狀排列。精原細胞大，圓形或卵圓形，核大，形狀與細胞一致；初級精母細胞小于精原細胞，圓形，核圓形；次級精母細胞小于初級精母細胞，圓形，數(shù)量比初級精母細胞多，核圓形；精細胞小，圓形，核大多呈半月形；精子最小，三角形，集中于生精小管腔中央，懸浮于精液中。

半乳糖和巖藻糖在紫貽貝的精巢的精細胞和成熟精子區(qū)為較均勻的弱陽性標(biāo)記，根據(jù)甘露糖和葡萄糖在貽貝精巢中的分布狀況，可將其分為4個區(qū)域（圖版Ⅱ）：輸精小管間隔區(qū)、輸精小管邊緣、精母細胞區(qū)、精子區(qū)，甘露糖僅在輸精小管邊緣有分布；葡萄糖的含量相對較多，但也只是在輸精小管邊緣以及成熟精子區(qū)有一定的標(biāo)記。

表2 貽貝精子細胞熒光凝集素標(biāo)記強度Tab.2 Reaction of FITC-labeled lectin on sperms of M.edulis

3 討論

3.1 糖在紫貽貝卵細胞的分布

前人[3]通過觀察卵的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，大多未受精的動物卵細胞由糖蛋白外被或卵黃膜包圍著，貝類也不例外，鮑的卵細胞由一層隆起的、約6 μm厚的卵黃膜包被，該層卵黃膜由很多糖蛋白纖絲緊密纏繞構(gòu)成[4]。本研究證實，甘露糖、巖藻糖在貽貝卵膜區(qū)無明顯標(biāo)記，半乳糖和葡萄糖在一些卵細胞邊緣有區(qū)域性分布，說明不同糖在卵細胞膜上的分布和含量存在變化，而這些變化直接影響著卵細胞膜上糖蛋白中糖的組成和結(jié)構(gòu)，可能造成不同品種貽貝卵細胞上配子識別物的差異，進而決定其配子之間的特異性識別。

紫貽貝卵細胞質(zhì)中4種凝集素均表現(xiàn)為弱陽性標(biāo)記，說明卵細胞中含有甘露糖、半乳糖、巖藻糖、葡萄糖等糖基，還可能存在若干我們未檢測到的其他種類的糖。這些糖在細胞質(zhì)中以何種方式存在還未知。人們通過研究鋸緣青蟹Scylla serrata[5]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[6]、羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii[7]、中國鱟 Tachpleus tridentatus[8]、縊蟶 Sinonovacula constricta[9]、櫛孔扇貝 Chlamys(Azumapecten)farreri[10]、太平洋牡蠣Olympia oysters[11]、文蛤Meretrix meretrix、微黃鐮玉螺Lunatia gilva[12]等無脊椎動物的卵細胞超微結(jié)構(gòu)及卵黃形成過程發(fā)現(xiàn)，卵黃的形成與細胞核、線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體等細胞器密切相關(guān)，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是卵黃粒形成的主要場所，并且粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又與糖類的合成有關(guān)，因此來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的卵黃顆粒中往往含有一定的糖類物質(zhì)；高爾基體具有合成糖蛋白的功能，所以經(jīng)過高爾基體釀造、加工而形成的卵黃粒中含有糖蛋白。本實驗中貽貝的卵細胞質(zhì)中，4種糖均有弱陽性標(biāo)記，可能就是那些來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的卵黃顆粒通過其中糖蛋白與熒光標(biāo)記凝集素結(jié)合而表現(xiàn)出來的。另外，羅氏沼蝦的卵細胞在卵黃形成后期，仍能見到高爾基體通過它的細小管道向已形成的卵黃粒輸送它的合成產(chǎn)物[6]，櫛孔扇貝卵細胞成熟過程中，細胞質(zhì)中的糖成分不斷增多[13]。本研究中的4種糖在紫貽貝細胞質(zhì)中廣泛存在，這些糖類可能存在于卵細胞質(zhì)中的卵黃顆粒中，其存在形式不只是糖蛋白，也可能還包括多糖類物質(zhì)。

3.2 精子中糖的分布

精子中的配子識別物位于頂體中，VACQUIER等[14]曾對鮑精子識別蛋白進行研究發(fā)現(xiàn)，決定生殖隔離的識別蛋白（lysin和sp18）就位于成體鮑的發(fā)達頂體泡中。本研究中半乳糖和巖藻糖在紫貽貝精巢的精細胞和成熟精子區(qū)為較均勻的弱陽性標(biāo)記，甘露糖僅在輸精小管邊緣有分布；葡萄糖的含量相對較多，但也只是在輸精小管邊緣以及成熟精子區(qū)有一定的標(biāo)記，該結(jié)果說明，貽貝精子形成過程中，不同糖類物質(zhì)的產(chǎn)生的先后順序有所差別，起到識別作用的糖蛋白的組成和分布也可能不同。該結(jié)論與前人研究哺乳動物[15]及昆蟲[16]精子得到的糖蛋白分布具有變化性特征的結(jié)論相似。

成熟精子中糖主要存在于精子的頂體部分，頂體是由前頂體顆粒逐漸發(fā)育形成的，前頂體顆粒出現(xiàn)的時期在不同貝類中有差異，合浦珠母貝Pinctada fucata在初級精母細胞期形成，而企鵝珍珠貝Pteria penguin則在次級精母細胞和精子細胞時期形成[17]，櫛孔扇貝前頂體顆粒在次級精母細胞初期開始形成，在精子細胞變態(tài)的早期是一個繼續(xù)和增強的過程[18]。紫貽貝的精子發(fā)生過程中，葡萄糖基的分布變化特征最為明顯，但這種糖類物質(zhì)是在精細胞發(fā)育階段的哪一期產(chǎn)生，是在前頂體顆粒形成時已經(jīng)存在，在頂體發(fā)育過程中包裝到頂體泡中，還是隨著頂體的形成而逐步合成的，需要用電鏡的方法進一步確定。另外，許多研究者借助能與糖專一性結(jié)合的凝集素對各種哺乳動物精子表面糖復(fù)合物進行研究表明，精子表面的糖復(fù)合物出現(xiàn)與睪丸內(nèi)的發(fā)生階段，在附睪內(nèi)的成熟過程中發(fā)生明顯的修飾，而體外或體內(nèi)獲能時仍有某種程度的改變。貽貝和哺乳動物的這種變化特征除了與種的特異性有關(guān)以外，還可能與其生理功能的發(fā)揮密切相關(guān)。

細胞表面糖蛋白中糖的特性對于細胞的相互識別起著重要作用，無論是實驗條件下使配子細胞表面的糖殘基缺失，還是由于自身免疫病使精子表面糖基被掩蓋均可導(dǎo)致精卵不能結(jié)合，這表明配子細胞表面糖蛋白的糖組分是精卵結(jié)合所必需的。精卵識別是精子頭部表面糖蛋白的糖殘基與卵細胞表面糖蛋白的糖殘基互補配對的過程，即互補的結(jié)合位點匹配的過程，這是保證配子種間特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)。本研究證實在紫貽貝精巢和卵巢分布區(qū)不同程度含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖，糖種類和數(shù)量的差異體現(xiàn)了配子細胞表面糖基的組成的差別，決定了同種生物配子間識別的特異性。鄧澤沛等[15]研究指出，麥胚凝集素（WGA）結(jié)合糖復(fù)合物是精卵結(jié)合所必需的，是否其他幾種凝集素所結(jié)合的糖復(fù)合物也在精卵識別及結(jié)合中也發(fā)揮必不可少的作用，以及在低等貝類中，這些凝集素受體是否也具有該特征，還需要進一步驗證。

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圖版Ⅰ 紫貽貝卵巢組織結(jié)構(gòu)及糖分布PlateⅠ Histological structure and carbohydrate distribution of ovary in Mytilus edulis

圖版Ⅱ 紫貽貝精巢組織結(jié)構(gòu)及糖分布PlateⅡ Histological structure and carbohydrate distribution of spermary in M.edulis