3株產(chǎn)β－甘露聚糖酶菌株的分離和鑒定

趙仲麟，馬 鑫，袁 超，李 燕，李淑英

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息研究所，北京 100081;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081;4.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

β－甘露聚糖酶是一類能夠降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖的半纖維素水解酶，作為添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，同時(shí)在食品、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、造紙和紡織業(yè)中也具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1］.β－甘露聚糖酶主要來源于微生物，在細(xì)菌、真菌、放線菌中均有發(fā)現(xiàn)［2～4］.而工業(yè)高溫環(huán)境中酶的熱穩(wěn)定性差一直是急需解決的問題，通過各種方法獲得高酶活性和高耐受能力的β－甘露聚糖酶是解決這一問題的有效途徑.中國的微生物資源豐富，通過建立共享酶源微生物資源庫及遺傳操作生物材料庫，篩選獲得具有新功能的酶蛋白，分離其編碼基因，發(fā)掘新的生物催化劑基因資源及具有工業(yè)潛在應(yīng)用價(jià)值的微生物菌株或功能基因是目前國家重點(diǎn)支持的研究方向.極端環(huán)境微生物具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，其中蘊(yùn)含大量獨(dú)特的酶基因資源.本研究從新疆極端干燥環(huán)境采集的土樣中，經(jīng)篩選獲得3株具有β－甘露聚糖酶活性的菌株，并對(duì)其進(jìn)行的分子生物學(xué)的鑒定.以便為進(jìn)一步尋找及開發(fā)有價(jià)值的產(chǎn)β－甘露聚糖酶的微生物奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)土樣來源 試驗(yàn)土壤樣品從新疆極端干燥環(huán)境中采集.

1.1.2 培養(yǎng)基 1)富集培養(yǎng)基的配制方法.稱取魔芋精粉20 g，酵母膏5 g，蛋白胨3 g，NaCl 5 g，溶于1 L蒸餾水中，pH值為6.0，121℃ 高壓蒸汽滅菌.2)固體分離培養(yǎng)基的配制方法.魔芋精粉10 g，NaNO33 g，MgSO4· 7H2O 5 g，KCl 5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 10 g，pH值為6.0，溶于1 L蒸餾水中，121℃ 高壓蒸汽滅菌.3)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法.分別稱取魔芋精粉10 g，酵母膏5 g，蛋白胨3 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 5 g，KCl 5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，溶于1 L 蒸餾水中，pH 值為 6.0，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌后備用.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選 稱取1 g土壤樣品放入10 mL富集培養(yǎng)基中，37℃，160 r·min－1搖床培養(yǎng)6 d.將培養(yǎng)液離心后取上清液，用去離子水按不同比例梯度稀釋，涂布于以魔芋精粉為碳源的固體分離培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱溫育4 d.待長出菌落后反復(fù)劃線分離，選取菌落小而水解圈大的單菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.2.2 菌株基因組的提取 挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取10 mL菌液用于基因組DNA的提取.使用Omega公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒提供的操作說明提取基因組DNA，DNA置于－20℃保存.

1.2.3 16S rRNA的PCR擴(kuò)增與測序 設(shè)計(jì)細(xì)菌通用16S rRNA引物，正向引物F27:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和反向引物R1492:5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，以基因組 DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增該菌株的16S rRNA基因，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成.PCR 反應(yīng)體系(50 μL):模板 DNA 2 μL，正反向引物各 1 μL(20 μmol·L－1)，10 × buffer 5 μL，Ex Taq 酶(TaKaRa)0.5 μL，去離子水 40.5 μL.PCR參數(shù)為:94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃補(bǔ)充延伸8 min，4℃ 保存.經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后用DNA回收試劑盒(Omega)回收目的片段.16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物用pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化 E.coli JM109后，由北京諾賽公司測序.

1.2.4 基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析 測序后序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析后，將所測得的16S rRNA基因序列與GeneBank中已知的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

從新疆極端干燥的土壤中培養(yǎng)出含量豐富的細(xì)菌，涂布于含有魔芋精粉的固體培養(yǎng)基中，篩選出3株菌落小而水解圈相對(duì)較大的菌株(圖1)，分別命名為 MX-1，MX-3，MX-10.

圖1 在以魔芋精粉為碳源的固體培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)Fig.1 Bacterial colonial morphology used konjaku flour as the only carbon source

本試驗(yàn)采用水解圈篩選法［5］，生長在含有葡甘露聚糖(魔芋精粉)的固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌被誘導(dǎo)產(chǎn)生β－甘露聚糖酶，從而分解菌落周圍的甘露聚糖形成透明圈.根據(jù)單菌落水解圈相對(duì)大小，則可初步判斷菌株產(chǎn)β－甘露聚糖酶情況.由圖1可知，培養(yǎng)后的3株菌有較強(qiáng)的水解甘露聚糖的能力.其中MX-10水解圈最大，同時(shí)圈內(nèi)部形成許多細(xì)小的白色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，另外2株菌沒有發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象.

2.2 菌株16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增

以預(yù)先提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出的16S rRNA基因片段，大小約為1.5 kb，與預(yù)期大小相符(圖2).

圖2 菌株16S rRNA PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of 16S rRNA of three strains

3株菌的16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物測序后，分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì).將相似序列下載，并選取一些模式菌株，用MEGA軟件和Neighbor-joining法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).由圖3可知，菌株 MX-1與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)位于同一分支，同源性達(dá)99%，推斷MX-1為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii);MX-3與多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)位于同一分支，同源性達(dá)99%，推斷其很可能為多粘類芽孢桿菌.而MX-10則與芽孢桿菌Bacillus subtilis，Bacillus amyloliquefaciens和 Bacillus tequilensis 3株菌位于同一分支，同源性達(dá)99%，鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬.

圖3 16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences

3 結(jié)語

本研究從新疆極端環(huán)境土壤中篩選到了3株具有β－甘露聚糖酶活性的菌株.其中MX-3菌株鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa).多粘類芽孢桿菌是一種生防菌，對(duì)植物黃萎病、油菜腐爛病等多種植物病害均具有一定的抑制作用.對(duì)人或動(dòng)植物無致病性，某些菌株可產(chǎn)生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶等多種生物活性物質(zhì).這些活性物質(zhì)在植物病害防治以及人和動(dòng)物疾病治療方面具有誘人的應(yīng)用前景［6］.美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物種類之一［7］.而本研究分離得到的多粘類芽孢桿菌展示出了良好的β－甘露聚糖酶活性.本研究分離到的菌株MX-1鑒定為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，同樣展示出較好的β－甘露聚糖酶活性，可作為克隆β－甘露聚糖酶基因的候補(bǔ)菌株.MX-10的16S rRNA比對(duì)結(jié)果表明，該菌與Bacillus subtilis等芽孢桿菌屬細(xì)菌同源性達(dá)99%.作者已從MX-10菌株中克隆得到β－甘露聚糖酶基因，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，得到的β－甘露聚糖酶具有較高的酶活性和熱穩(wěn)定性［8］.β－甘露聚糖酶基因的克隆和酶蛋白表達(dá)一直是飼料研究中的熱點(diǎn)，研究人員都在尋找具有良好特性、可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的植酸酶［9～12］.隨著研究的不斷深入，β－甘露聚糖酶新基因的發(fā)現(xiàn)將會(huì)給環(huán)保型飼料添加劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來新的機(jī)遇.

［1］向冰冰，崔岱宗.β－甘露聚糖酶的營養(yǎng)功能及其在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2009(5):85－87.

［2］李文玉，董志揚(yáng)，崔福綿.枯草芽孢桿菌中性內(nèi)切β-甘露聚糖酶的純化及性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，40(4):420－424.

［3］張樹飛，鄔敏辰，盛金萍.酸性β－甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變育種［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16(2):346－350.

［4］吳 襟，何秉旺.諾卡氏菌形放線菌β－甘露聚糖酶的純化和性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2000，40(1):69－73.

［5］FUELOEP L，PONYI T.Rapid screening for endo-betal，4-glucanase and endo-beta-1，4-mannanase activities and specific measuerment using soluble dye-labelled substrates［J］.Journal of Microbiological Methods，1997，29(l):15－21.

［6］RAZA W，YANG W，SHEN Q R.Paenibacillus polymyxa:antibiotics，hydrolytic enzymesand hazard assessment［J］.Journal of Plant Pathology，2008，90(3):419－430.

［7］BENT E.Surface colonization of lodgepole pine(Pinus contora Var.latifolia)roots by Pseudomonas and Paenibacillus polymyxa under antibiotic conditions［J］.Plant Soil，2002，2:187 －196.

［8］馬 鑫，趙仲麟，李 亮，等.芽孢桿菌β－甘露聚糖酶基因的克隆及表達(dá)［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009(2):77－81.

［9］LIN J，PANTALONE V，LI G，et al.Molecular cloning and biochemical characterization of an endo-beta-mannanase gene from soybean for soybean meal improvement［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(9):4622－4628.

［10］PAN X，ZHOU J，TIAN A，et al.High level expression of a truncated beta-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp.N16-5 in Kluyveromyces cicerisporus［J］.Biotechnology Letters，2011，33(3):565－570.

［11］SUMMPUNN P，CHAIJAN S，ISARANGKUL D，et al.Characterization，gene cloning，and heterologous expression of beta-mannanase from a thermophilic Bacillus subtilis［J］.Journal of Microbiology，2011，49(1):86 －93.

［12］ABDESHAHIAN P，SAMAT N，HAMID A，et al.Utilization of palm kernel cake for production of beta-mannanase by Aspergillus niger FTCC 5003 in solid substrate fermentation using an aerated column bioreactor［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2010，37(1):103－109.