用EST-SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)21份黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性

劉俊青，李佩芳，胡建斌，李建吾，陶 翠

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界各地廣泛栽培的蔬菜作物，其栽培面積僅次于番茄、洋蔥和大白菜［1］.中國(guó)是黃瓜栽培和生產(chǎn)大國(guó)，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2007年中國(guó)黃瓜總產(chǎn)量達(dá)2 805萬(wàn)t，產(chǎn)值4.6億美元，產(chǎn)量和產(chǎn)值均居世界第1位［2］.一般認(rèn)為，黃瓜起源于印度，中國(guó)是黃瓜的次級(jí)起源中心之一［3，4］.盡管中國(guó)黃瓜資源豐富，分布有華北型、華南型、歐洲溫室型、歐美加工型等不同類型［5］，但黃瓜遺傳背景狹窄是不爭(zhēng)的事實(shí)［4，6］，這不利于其雜交育種工作的開展.迄今，多種分子標(biāo)記(如RAPD，AFLP，ISSR，SSR 等)已應(yīng)用于黃瓜種質(zhì)資源研究和遺傳多樣性分析［7］，為其育種研究提供了基礎(chǔ)性遺傳信息，但這些標(biāo)記往往是擴(kuò)增基因組中非表達(dá)序列或在基因組中隨機(jī)擴(kuò)增，所得到的位點(diǎn)一般與目的基因(控制性狀的基因)相距甚遠(yuǎn)，不能反映功能基因的多態(tài)性，這在某種程度上限制了它們的應(yīng)用.因此，人們期望能夠檢測(cè)到基因內(nèi)多態(tài)性功能位點(diǎn)的分子標(biāo)記.EST-SSR起源于基因表達(dá)序列，其多態(tài)性是基因內(nèi)微衛(wèi)星位點(diǎn)變異的反映，是一種潛在的功能標(biāo)記［8］.與常規(guī)的分子標(biāo)記相比，EST-SSR標(biāo)記能檢測(cè)到基因內(nèi)的可變位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)很可能與該植物的性狀相關(guān)，因而可為植物育種提供更有價(jià)值的遺傳信息.目前，人們已在多種高等植物中開發(fā)出大量的EST-SSR標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記在植物遺傳多樣性分析中具有較好的實(shí)用價(jià)值［9］.本研究利用前期從黃瓜EST序列中開發(fā)出部分EST-SSR引物［10］，分析不同黃瓜品種的遺傳多樣性，旨在為黃瓜育種中選擇具有真正意義上的多樣性的材料提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料包括21份黃瓜自交系或品種，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜遺傳育種課題組提供.這些材料包括 10 份華北型黃瓜(53，57，86，102，107，D01108，D0462，HR，Jinyou30和 Jinyou10)、6 份華南型黃瓜(109，HN007，HN010，HN013，HN016 和 HN022)、4份歐洲溫室型黃瓜(D0351，112，D0442和DZ1)和1份野生種“SHG”.其中，4份歐洲溫室型黃瓜主要引自荷蘭，其他材料是從國(guó)內(nèi)各地收集后選育所得.采用CTAB小量法［11］提取所有黃瓜材料的基因組DNA.

1.2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

SSR引物為從黃瓜EST序列中開發(fā)所得［10］.PCR 反應(yīng)體系 15 μL，包括 1 × buffer，50 ng 模板DNA，1.5 mmol·L－1MgCl2，200 μmol·L－1dNTPs，0.4 μmol·L－1引物，0.75 U Taq 酶，所有反應(yīng)在PTC－200型基因擴(kuò)增儀(MJ Research)上進(jìn)行.反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，50～58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后在72℃保溫8 min.

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染

采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(m丙烯酰胺:V甲叉雙丙烯酰胺=19∶1)電泳，上樣量3 μL，并在凝膠兩側(cè)點(diǎn)上Marker(pUC19 DNA/MspI).在250 V電壓下電泳1.5 h，然后按照優(yōu)化的銀染方法染色、照相［12］.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)ANDERSON等［13］報(bào)道的方法計(jì)算ESTSSR標(biāo)記的多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)，即 PIC=1－ ∑X2i，其中，Xi表示第i種基因型出現(xiàn)的頻率.將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無(wú)帶或弱帶記為“0”，建立數(shù)字化矩陣.利用NTSYS-pc2.10軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用NEI和LI的方法［14］計(jì)算各材料之間的相似系數(shù)，以UPGMA法對(duì)材料進(jìn)行聚類作圖，并進(jìn)行主坐標(biāo)(Principal coordinate analysis，PCoA)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物特征

從前期研究結(jié)果［10］中選擇出擴(kuò)增條帶清晰的15對(duì)EST-SSR引物(表1).這15對(duì)引物包括11種重復(fù)基元，其中二核苷酸重復(fù)2種，三核苷酸重復(fù)8種，六核苷酸重復(fù)1種.基元重復(fù)5～16次，引物E41和E50基元重復(fù)次數(shù)最低，E56重復(fù)次數(shù)最高.所有引物的理論產(chǎn)物大小為155～287 bp.這些引物所在的EST的功能涉及有能量代謝、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、光合系統(tǒng)等.

2.2 EST-SSR 多態(tài)性

利用15對(duì)EST-SSR引物對(duì)21份黃瓜材料進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有引物均能檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn).每對(duì)引物所檢測(cè)到的等位基因數(shù)在2(EC56)至7(EC31和EC54)之間，總數(shù)65個(gè)，平均4.33個(gè)(表2).所有引物擴(kuò)增出的等位基因片段大小均在理論值上下波動(dòng)，說(shuō)明等位基因變異主要是由微衛(wèi)星數(shù)量變化所致.引物EC39的擴(kuò)增帶譜如圖1所示.

PIC值是反映所用引物區(qū)分材料的能力，是衡量引物多態(tài)性的一個(gè)重要指標(biāo).為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)各引物的多態(tài)性，計(jì)算了各對(duì)引物的PIC值(表2).引物EC34的 PIC值最高，達(dá) 0.748，引物 EC50的PIC值最低，僅為0.177.所有引物的PIC平均值為0.470.按照 BOTSTEIN 等［15］的觀點(diǎn)，當(dāng) PIC ＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)基因座，PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)性.在所用的15對(duì)EST-SSR引物中，8對(duì)引物具有高度多態(tài)性，4對(duì)引物具有中度多態(tài)性，僅3對(duì)引物為低度多態(tài)性.表明選用的15對(duì)EST-SSR引物具有較好的多態(tài)性.

表1 15對(duì)EST-SSR引物的特征Table 1 Characteristics of 15 EST-SSR primer pairs in cucumber

圖1 EST-SSR引物EC39在21份黃瓜材料中的擴(kuò)增帶譜Fig.1 Band pattern of EST-SSR primer pair EC39 among 21 cucumber accessions

2.3 黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性

利用NTSYS-pc2.10軟件分析發(fā)現(xiàn)，21份黃瓜材料的相似系數(shù)變幅為0.608 ～0.980，其中DZ1和102相似系數(shù)最小，可考慮作為一個(gè)比較理想的親本組合，Jinyou10和Jinyou30相似系數(shù)大，它們可能是某個(gè)親本的雜交后代.所有材料的平均相似系數(shù)為0.797，即平均遺傳距離0.203，證明了黃瓜遺傳背景狹窄.采用UPGMA算法對(duì)21份黃瓜種質(zhì)進(jìn)行聚類作圖，結(jié)果見圖2.在相似系數(shù)為0.732水平上，21份黃瓜材料可明顯分為2類(Ⅰ和Ⅱ類)，其中 4份歐洲溫室型種質(zhì)(D0442，DZ1，112和D0351)和1份華南型種質(zhì)HN010聚在I類，其他16份中國(guó)本地種質(zhì)則聚在Ⅱ類.這充分說(shuō)明外來(lái)種質(zhì)與國(guó)內(nèi)種質(zhì)遺傳背景差異甚大，而華南型種質(zhì)HN010很有可能具有歐洲黃瓜種質(zhì)的血緣.Ⅱ類包括10份華北型種質(zhì)、5份華南型種質(zhì)和1份野生種，并可再次細(xì)分為A，B，C 3亞類.其中A類包括所有的華北型種質(zhì)和1份華南型種質(zhì)109，此類種質(zhì)平均相似系數(shù)達(dá)0.931，說(shuō)明華北型黃瓜種質(zhì)遺傳背景十分狹窄.B類種質(zhì)包括剩余的4份華南型種質(zhì)(HN022，HN007，HN013 和 HN016)，其中HN016與其他3份種質(zhì)相似系數(shù)較小，可能是一個(gè)比較理想的雜交候選親本材料.C類僅包括1份野生種SHG，它與國(guó)內(nèi)栽培種(華北型和華南型種質(zhì))可明顯分開，充分說(shuō)明了野生種和栽培種的遺傳差異.

表2 15對(duì)EST-SSR引物的多態(tài)性Table 2 The polymorphism of 10 EST-SSR primer pairs in cucumber

圖2 基于EST-SSR標(biāo)記的21份黃瓜材料的聚類圖Fig.2 A dendrogram of 21 cucumber accessions based on EST-SSR markers

為了更好的反映各材料之間的遺傳關(guān)系，以EST-SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)21份黃瓜材料進(jìn)行了PCoA分析.第1和第2特征向量分別解釋了23.9%和16.0%的變異，前3個(gè)特征向量共解釋了50.1%的變異.由圖3可知，21份黃瓜材料可明顯分為3個(gè)區(qū)域(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)，第Ⅰ區(qū)包括所有華北型種質(zhì)和1份華南型種質(zhì)109，即圖2中的A亞類;第Ⅱ區(qū)包括4份華南型種質(zhì)和1份野生種，即圖2中的B亞類和C亞類;第Ⅲ區(qū)包括所有歐洲溫室型種質(zhì)和1份華南型種質(zhì)HN010，即圖2中的Ⅰ大類.由此可見，聚類分析圖和PCoA圖對(duì)于21份黃瓜材料的劃分基本一致.

圖3 21份黃瓜材料的PCoA圖Fig.3 A PCoA dendrogram of 21 cucumber accessions

3 結(jié)論與討論

3.1 EST-SSR標(biāo)記在黃瓜遺傳多樣性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

迄今，RAPD，AFLP，ISSR等分子標(biāo)記已用于黃瓜遺傳多樣性評(píng)價(jià)［5，16～18］.在這些報(bào)道中，盡管外來(lái)種質(zhì)可與國(guó)內(nèi)種質(zhì)區(qū)分開，但國(guó)內(nèi)種質(zhì)則難以按照生態(tài)類型加以區(qū)分.大多研究者認(rèn)為這可能是由于自由傳粉或人工雜交所導(dǎo)致材料遺傳背景較復(fù)雜的緣故.本研究采用EST-SSR標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是采用聚類分析還是PCoA分析，絕大部分均可按照地理分布和生態(tài)類型不同加以區(qū)分.例如，4份來(lái)自荷蘭的種質(zhì)可與國(guó)內(nèi)本地材料明顯區(qū)分，華北型種質(zhì)與大部分華南型種質(zhì)亦可明顯區(qū)分，在聚類分析圖中野生種SHG與栽培種區(qū)別明顯.這充分說(shuō)明EST-SSR標(biāo)記在黃瓜遺傳多樣性研究中具有很好的實(shí)用性，而且材料鑒別能力明顯優(yōu)于RAPD，AFLP，ISSR等分子標(biāo)記.其原因除了采用了具有典型性狀的高代自交系(除品種Jinyou30和Jinyou10)外，很有可能是本研究采用了源于基因表達(dá)序列的EST-SSR標(biāo)記，而這些標(biāo)記所檢測(cè)的變異位點(diǎn)可能與黃瓜某些性狀(如果實(shí)性狀)相關(guān).利用EST-SSR標(biāo)記分析了黃瓜近緣種——甜瓜的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)栽培種中的薄皮甜瓜與厚皮甜瓜也能明顯區(qū)分開［19］，這也支持了本研究結(jié)果.

3.2 21份黃瓜種質(zhì)的應(yīng)用前景

聚類圖和PCoA圖對(duì)21份黃瓜種質(zhì)的劃分基本一致.國(guó)內(nèi)栽培種質(zhì)主要集中在聚類圖中Ⅱ類和PCoA圖中的Ⅰ/Ⅱ區(qū)，且相似系數(shù)較高，意味著在雜交育種中，以這類種質(zhì)為親本所獲得的F1代雜交優(yōu)勢(shì)不明顯，黃瓜果實(shí)增產(chǎn)空間可能十分有限，但可對(duì)個(gè)別性狀進(jìn)行改良.例如，HR高抗黃瓜霜霉病，而109低抗霜霉病但綜合性狀優(yōu)良，109×HR子代很可能是抗霜霉病的優(yōu)良品種，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)109抗病性進(jìn)行改良.野生種SHG基因組包含多種抗病和抗逆基因，由于SHG(聚類圖中Ⅱ－C亞類)與國(guó)內(nèi)栽培種質(zhì)有一定的遺傳距離，因此SHG與國(guó)內(nèi)栽培種質(zhì)雜交后的分離群體(F2)將會(huì)出現(xiàn)廣泛的基因分離，從中可能選擇到具有抗病和抗逆性的栽培種質(zhì).4份國(guó)外種質(zhì)和1份國(guó)內(nèi)種質(zhì)HN010處于聚類圖Ⅰ類和PCoA圖Ⅲ區(qū)，與其他種質(zhì)有明顯的區(qū)別，且有較大遺傳距離，以其作為親本與國(guó)內(nèi)栽培黃瓜(特別是華北型種質(zhì))進(jìn)行雜交，不僅有利于實(shí)現(xiàn)黃瓜高產(chǎn)育種，還可拓寬國(guó)內(nèi)黃瓜遺傳背景，豐富其基因資源.

［1］PITRAT M，CHAUVET M，F(xiàn)OURY C.Diversity，history，and production of cultivated cucurbits［J］.ISHS Acta Horticulturae，1999，492:21－28.

［2］FAO.FAO STAT［EB/OL］.(2009－11－20)［2011－06 －20］.http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx

［3］STAUB J E，SERQUEN F C，MCREIGHT J D.Genetic diversity in cucumber(Cucumis sativus L.):III.An evaluationof Indian germplasm［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，1997，44(4):315－326.

［4］STAUB J E，SERQUEN F C，HOREJSI T，et al.Genetic diversity in cucumber(Cucumis sativus L.):IV.An evaluation of Chinese germplasm［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，1999，46(3):297－310.

［5］張海英，王永健，許 勇，等.黃瓜種質(zhì)資源遺傳親緣關(guān)系的RAPD分析［J］.園藝學(xué)報(bào)，1998，25(4):345－349.

［6］STAUB J E，CHUNG S M，F(xiàn)AZIO G.Conformity and genetic relatedness estimation in crop species having a narrow genetic base:the case of cucumber(Cucumis sativus L.)［J］.Plant Breeding，2005，124(1):44 －53.

［7］丁國(guó)華，秦智偉.黃瓜的分子標(biāo)記和連鎖圖譜研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20(6):14－18.

［8］VARSHNEY R K，GRANER A，SORRELLS M W.Genic microsatellite markers in plants:features and applications［J］.Trends in Biotechnology，2005，23(1):48－55.

［9］姜春芽，廖 嬌，徐小彪，等.植物EST-SSR技術(shù)及其應(yīng)用［J］.分子植物育種，2009，7(1):125－129.

［10］HU J B，ZHOU X Y，LI J W.Development of novel EST-SSR markers for cucumber(Cucumis sativus)and their transferability to related species［J］.Scientia Horticlturae，2010，125(3):534 －538.

［11］DOYLE J J，DOYLE J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue［J］.Focus，1990，12:13 －15.

［12］胡建斌，李 靜，袁 鳴，等.PAGE凝膠制備方法和銀染方法的改進(jìn)［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(4):742－745.

［13］ANDERSON J A，CHURCHILL G A，AUTRIQUE J E，et al.Optimizing parental selection for genetic linkage maps［J］.Genome，1993，36(1):181 －186.

［14］NEI M，LI W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonuclease［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1979，76(10):5296－5273.

［15］BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism［J］.Am J Hum Genet，1980，32(3):314 －331.

［16］李錫香，朱德蔚，杜永臣，等.黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD鑒定與分類研究［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5(2):147－152.

［17］張桂華，韓毅科，楊瑞環(huán)，等.黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22(3):21－24.

［18］王 佳，徐 強(qiáng)，繆旻珉，等.黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］.分子植物育種，2007，5(5):677－682.

［19］胡建斌，李建吾.甜瓜EST-SSR位點(diǎn)信息及標(biāo)記開發(fā)［J］.園藝學(xué)報(bào)，2009(4):513－520.