響應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉中黃酮提取工藝

周海旭，高 晗，曲良苗，李忠海

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410001;2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

山楂為薔薇科山楂屬(Crataegus L.)植物，其葉片中含有的黃酮類(lèi)化合物具有降壓、降血脂、軟化血管、增加冠狀動(dòng)脈流量、助消化等藥理作用.隨著人們健康觀念的更新以及對(duì)黃酮類(lèi)化合物生物活性的認(rèn)識(shí)，其開(kāi)發(fā)利用已成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)［1］.黃酮類(lèi)化合物的來(lái)源廣泛存在于多種天然植物中，現(xiàn)主要從銀杏葉、葛根等天然植物中提取黃酮，但其含量較低，提取效率受到限制［2］.而中國(guó)山楂葉資源豐富，價(jià)格低廉，富含黃酮類(lèi)成分，且含量高于傳統(tǒng)藥食部位果實(shí)［3］.本研究以山楂葉為原料，采用有機(jī)溶劑提取黃酮抗氧化物質(zhì)，以總黃酮提取量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉黃酮的提取工藝條件，既為開(kāi)發(fā)新型天然抗氧化劑提供可靠的研究數(shù)據(jù)，又可提高山楂樹(shù)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

材料:冷凍干燥山楂葉，產(chǎn)于新鄉(xiāng).

藥品:蘆丁、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純.

儀器:可見(jiàn)分光光度計(jì)WFJ7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 HH-4，金壇市杰瑞爾電器有限公司;循環(huán)水式真空泵 SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子天平HZT-A500，福州華態(tài)科學(xué)儀器有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密量取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加一定量的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解，放冷，完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至刻度，即得0.2 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液［4，5］.

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 取1.2.1中的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，2，4，6，8，10，12 mL 分別置于50 mL 比色管中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL搖勻，放置6 min;加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉試液10 mL，再加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇至25 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm處比色測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁含量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］.

1.2.3 山楂葉中總黃酮含量的測(cè)定方法 準(zhǔn)確稱(chēng)量1.00 g山楂葉粉末置于錐形瓶中，在一定溫度下用乙醇提取一段時(shí)間后，抽濾;將濾液用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至100 mL容量瓶中，搖勻，作為待測(cè)液;取2.50 mL 待測(cè)液按 1.2.2 所述方法，測(cè)定吸光度.根據(jù)回歸方程，由吸光度計(jì)算出被測(cè)液中黃酮含量C，然后由C計(jì)算出山楂片中總黃酮的含量［7，8］.

山楂葉黃酮提取量/(mg·g－1)=(40×C×10－3/山楂葉重量)×100%

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為30∶1，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇.于 60 ℃ 條件下分別提取 50，60，70，80 和90 min.

1.3.2 液料比對(duì)黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中.分別加入液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇60℃條件下回流提取60 min.

1.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為40∶1，分別加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液，60℃條件下回流提取60 min.

1.3.4 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為40∶1，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇分別在40，50，60，70 和 80 ℃條件下提取 60 min.

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用Design-Expert 7.1.6軟件中的中心組合試驗(yàn)(Central composite design，CCD)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)［9］.根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)A、提取溫度B和液料比C 3個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以黃酮提取量為響應(yīng)值.試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1.

表1 山楂葉中黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design for flavonoids extraction from hawthorn

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響

由圖1可知，提取時(shí)間為60 min吸光度達(dá)到最大，超過(guò)60 min后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，故選擇60 min為最佳提取時(shí)間.

圖1 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of extraction time on flavonoids yield

2.2 液料比對(duì)黃酮提取量的影響

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，黃酮提取量隨液料比的增大而呈上升趨勢(shì)，但液料比增大到一定程度后，黃酮提取量逐漸趨于飽和.因此選擇液料比在40∶1左右比較適宜.

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，黃酮的提取量逐漸增大.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，黃酮的提取量最高.超過(guò)該體積分?jǐn)?shù)后，黃酮的提取量反而下降，所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%左右比較適宜.

2.4 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響

由圖4可知，隨浸提溫度的升高，黃酮提取量逐漸增加.當(dāng)浸提溫度超過(guò)70℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì).因此選擇提取溫度在70℃左右比較適宜.

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on flavonoids yield

2.5 山楂葉黃酮提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

響應(yīng)面試驗(yàn)共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2.采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到以黃酮提取量為響應(yīng)值的回歸方程為:

由表3可知，以黃酮提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型P＜0.000 1，表明該二次方程模型顯著.說(shuō)明該模型可以用于指導(dǎo)山楂葉黃酮提取試驗(yàn)設(shè)計(jì).各因素對(duì)黃酮提取量的影響由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取溫度.響應(yīng)面分析法的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的各因素構(gòu)成的一個(gè)三維空間，可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用［10］，各因素間交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5.

表2 山楂葉中黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results for flavonoids extraction from hawthorn

表3 黃酮提取量的ANOVA分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model of flavonoids yield

由圖5可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比之間的交互作用對(duì)黃酮提取量有極顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度之間的交互作用對(duì)黃酮提取量有顯著影響，提取溫度與液料比之間的交互作用對(duì)黃酮提取量影響不顯著.

經(jīng)過(guò)Design-Expert 7軟件的分析，可以得出山楂片黃酮提取的最佳條件，結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證，確定其最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取溫度70℃、提取時(shí)間60 min，料液比42∶1.在此條件下黃酮提取量達(dá)到 7.44 mg·g－1.

圖5 兩兩因素交互作用對(duì)黃酮提取量的影響Fig.5 The pairwise interactive effects of extraction conditions on flavonoids yield

3 結(jié)論

本研究首先通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、浸提溫度和液料比對(duì)山楂葉黃酮提取量的影響，在此基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 7軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立了數(shù)學(xué)模型，得到了較優(yōu)的提取工藝條件.結(jié)合響應(yīng)面分析得到的數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)更優(yōu)的工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得到了黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間60 min、提取溫度70 ℃、液料比42∶1 mL·g－1，在此條件下黃酮提取量可達(dá) 7.44 mg·g－1.

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