紅曲霉菌株的誘變及其發(fā)酵條件研究

高國(guó)賦，魏寶陽(yáng)，楊 瀚，孫繼民

（1.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

紅曲霉 （Monascus purpureusWent.）別名 紅曲、紅糟、紅大米，是散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌，存在于樹(shù)木、土壤和堆積物等處。菌落初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色。紅曲色素是以紅曲米（經(jīng)紅曲霉菌發(fā)酵的秈稻、粳稻、糯米等）為原料，利用現(xiàn)代的生物技術(shù)提取而成的天然著色劑。紅曲色素對(duì)pH、溫度、金屬離子氧化還原劑等較其他天然色素穩(wěn)定，是一種優(yōu)良的食品天然色素。在食品天然色素中，紅曲色素一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行毒性試驗(yàn)證明：紅曲色素安全無(wú)毒。紅曲色素應(yīng)用于酒、糖果、熟肉制品、糕點(diǎn)等食品的著色，也可用于醫(yī)藥和化妝品的著色。目前，由于我國(guó)紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備、色素后期提取及精煉工藝比較落后，菌種產(chǎn)色的水平較低，色素生產(chǎn)成本較高，限制了紅曲色素在生產(chǎn)中的應(yīng)用。通過(guò)菌種誘變選育提高生產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，對(duì)我國(guó)食用色素產(chǎn)業(yè)的提升有著重要的意義。筆者采用紫外線和亞硝酸對(duì)紅曲霉進(jìn)行誘變，獲得突變株，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為紅曲色素的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料為紅曲霉（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院生物工程系保存）；儀器有滅菌鍋（TOMY SS-325）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（VIS-9100）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉紫外誘變處理 紫外燈照射時(shí)間分別為：30、60、90、120、150、180、210 s；將盛有孢子懸液的平皿置于震蕩器上充分振蕩，紫外燈下照射30 s后，接種于3個(gè)平板，暗處培養(yǎng)，操作完成后再次紫外線處理30 s，按此操作直到完成7個(gè)梯度的照射，30℃暗培養(yǎng)，3 d后觀察，選取比出發(fā)菌株菌落大、顏色深的菌落。

1.2.2 紅曲霉化學(xué)誘變處理 制備亞硝酸濃度為0.01、0.02、0.04、0.08 mol/L 的誘變固體平板培養(yǎng)基。每平板涂布接種孢子懸液，30℃培養(yǎng)，2 d后觀察生長(zhǎng)情況，選擇比出發(fā)菌株菌落大、顏色深的菌落，接種至不含亞硝酸的PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.3 誘變菌株發(fā)酵能力測(cè)定 接種誘變株孢子懸液1 mL至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、130 r/min培養(yǎng)7～8 d，取菌液，4 000 r/min 離心 15 min，用 75%乙醇作為空白對(duì)照測(cè)定波長(zhǎng)410 nm（黃色素）和510 nm（紅色素）處的OD值。

1.2.4 色價(jià)測(cè)定 胞外色素色價(jià)測(cè)定：在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，采用測(cè)定色素的色價(jià)來(lái)表示色素含量，色價(jià)（μ/mL）=測(cè)得的OD值×稀釋倍數(shù)，取2 mL發(fā)酵液過(guò)濾，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇做空白對(duì)照，分別在410 nm、510 nm處測(cè)定胞外紅黃色素和紅色素。

菌體色素色價(jià)測(cè)定：稱取菌體0.05 g，用70%乙醇溶解，定容至100 mL，振搖30 min后靜置，取1.0 mL溶液，加70%乙醇溶液9 mL，用70%乙醇溶液作空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)吸光度，按公式計(jì)算成品色價(jià)（μ/g）。

成品色價(jià)（μ/g）=OD510×1 000/樣品質(zhì)量

1.2.5 發(fā)酵條件的研究 發(fā)酵條件的影響因素選取按正交表L16（45）（見(jiàn)表1）的設(shè)計(jì)進(jìn)行液體培養(yǎng)。

表1 發(fā)酵條件研究的L16（45）正交表

（1）發(fā)酵條件與產(chǎn)色水平研究：菌液10 mL，4 000 r/min離心15 min，取上清液，以75%的乙醇作為空白對(duì)照，分別在510 nm測(cè)定紅色素和410 nm處測(cè)定黃色素，按公式計(jì)算總色價(jià)。

總色價(jià)=測(cè)得（OD410+OD510）×稀釋倍數(shù)。

（2）菌體量與發(fā)酵條件間關(guān)系的研究：菌液過(guò)濾，濾渣用蒸餾水反復(fù)沖洗至濾液無(wú)色透明，稱取菌體的濕重。同時(shí)每樣品挑取0.05 g菌體備用，余下菌體烘干后稱重。

（3）胞內(nèi)色素與胞外色素含量分析：取16只試管，每支加入75%的乙醇10 mL，取步驟（2）中的0.05 g菌體，30℃萃取24 h后，4 000 r/min離心15 min，取上清液在410 nm和510 nm處測(cè)定OD值并記錄，按公式計(jì)算每g濕菌體色價(jià)。

每克濕菌體色價(jià)=A值×100×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)紫外誘變和化學(xué)誘變后，分別篩選出了一株比出發(fā)菌株生長(zhǎng)快、菌落大、顏色深的優(yōu)良菌株，編為5-2和1-1-3，對(duì)應(yīng)的照射劑量和誘變劑量為150 s和0.04 mol/L，在對(duì)比試驗(yàn)中，5-2和1-1-3的發(fā)酵色價(jià)分別為7.09 U/mL和12.32 U/mL，并且1-1-3的生長(zhǎng)速度大大優(yōu)于5-2（見(jiàn)圖1）。因此最終篩選出1-1-3為最佳菌株，在同時(shí)接種的4只斜面試管中，1-1-3生長(zhǎng)最為密集，菌落厚約2 mm，2.5 d后有大量菌絲長(zhǎng)出，相比之下，5-2號(hào)菌落稀疏、2.5 d觀察時(shí)并未長(zhǎng)出菌絲；因此確定1-1-3為最佳誘變菌株。

圖1 紫外誘變與化學(xué)誘變菌株對(duì)比

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同因素對(duì)產(chǎn)色量的影響 從表2和表3可以看出，各條件下色素產(chǎn)量有差異，色素產(chǎn)量最低的是2號(hào)和8號(hào)，沒(méi)有菌體生長(zhǎng)，色素產(chǎn)量最高的是10號(hào)，其對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速160 r/min，pH為6，溫度為32℃，麥芽糖和牛肉膏。

從表2中可以看出，對(duì)胞外色素產(chǎn)量影響由大到小依次為：溫度>氮源>碳源>pH值>轉(zhuǎn)速，最適培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為 160 r/min，pH 值為 6，32℃，麥芽糖和牛肉膏；不同的溫度對(duì)胞外色素產(chǎn)量影響最大，最適宜溫度為32℃，不同氮源胞外色素產(chǎn)量差異較大，無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)均在比較低的水平。

從表2中還可以看出，對(duì)胞內(nèi)色素產(chǎn)量影響由大到小依次為：氮源>pH值>碳源>溫度>轉(zhuǎn)速，最適培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速為130 r/min，pH值為5，26℃，麥芽糖和硝酸鈉。培養(yǎng)環(huán)境偏酸性，產(chǎn)色量與溫度成反比，與胞外色素情況相反，胞內(nèi)色素對(duì)硝酸鈉的吸收較好。

2.2.2 不同因素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 各因素對(duì)干重與濕重的影響效果大致相同，按影響的重要性從大到小依次為：溫度>碳源>氮源>轉(zhuǎn)速>pH值。

2.2.3 紅色素與黃色素產(chǎn)量間的關(guān)系 從表3中可以看出，在細(xì)胞外部，黃色素產(chǎn)量普遍大于紅色素，單個(gè)常量最多是黃色素；總色素的產(chǎn)量以1號(hào)、7號(hào)、10號(hào)為多，所有條件中紅、黃色素產(chǎn)量差異較大的也是前述3瓶，可見(jiàn)產(chǎn)量越大，兩種色素產(chǎn)量差異越大，但不超過(guò)20%。在細(xì)胞內(nèi)部，色素產(chǎn)量總體偏低，黃色素產(chǎn)量普遍大于紅色素，與胞外色素一樣，色素總產(chǎn)量越大，紅黃色素產(chǎn)色量的差異越大。紅色素產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件與菌絲生長(zhǎng)除pH值因素以外基本相同，偏中性有利于紅色素的合成，最佳條件也與胞外色素的最佳條件一致，說(shuō)明胞外色素在色素總產(chǎn)量中占主要部分。研究結(jié)果表明，黃色素的最佳發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速160 r/min，pH值為5，溫度32℃，麥芽糖和牛肉膏，與紅色素基本相同。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 各條件下胞內(nèi)外色素含量與干濕重

3 討論

通過(guò)紫外誘變和以亞硝酸為誘變劑的化學(xué)誘變，得到了一株生長(zhǎng)速度快、顏色深、穩(wěn)定性好的突變株1-1-3號(hào)。紫外誘變和化學(xué)誘變這兩種傳統(tǒng)方法仍然是育種的有效手段，操作簡(jiǎn)便、成本低、效果好，但是也存在缺點(diǎn)：工作量極大、定向誘變難度大，誘變劑量過(guò)大易引起負(fù)突變株比例增加，而且化學(xué)誘變?cè)噭?duì)環(huán)境和人體都有一定危害，如果能在代謝水平和基因水平上有所突破，那么傳統(tǒng)誘變方法有望退出人們的視線。

在發(fā)酵條件的研究中發(fā)現(xiàn)，紅曲霉所產(chǎn)的色素大部分分泌到胞外，產(chǎn)胞外色素最佳條件為：轉(zhuǎn)速160 r/min，pH 值為 6，32℃，麥芽糖和牛肉膏；產(chǎn)胞內(nèi)色素最佳條件為：轉(zhuǎn)速 130 r/min，pH值為5，26℃，麥芽糖和硝酸鈉；菌體生長(zhǎng)最佳條件為：轉(zhuǎn)速160 r/min，pH值為6，32℃，葡萄糖和牛肉膏。

紅色素和黃色素波長(zhǎng)的最大吸收峰分別為510 nm和410 nm。從研究結(jié)果來(lái)看，胞內(nèi)和胞外的兩種色素產(chǎn)量差異幅度較小，基本成正比，總色價(jià)較大的搖瓶中兩色素色價(jià)相差的絕對(duì)值比總色價(jià)小的要大，可能是因?yàn)榧t色素和黃色素在代謝途徑上游有相同的前體物質(zhì)，而在代謝途徑下游的酶活性差異較大，相同的前提物質(zhì)合成量越大，最終產(chǎn)物—色素的產(chǎn)量差異也就越大。紅曲色素產(chǎn)量與氮源的種類密切相關(guān)，有機(jī)氮的利用優(yōu)于無(wú)機(jī)氮；試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，酸性條件下有利于黃色素的合成，在生產(chǎn)發(fā)酵中如需增加紅色素的產(chǎn)量，可以通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值偏中性來(lái)達(dá)到增產(chǎn)的目的；胞外色素產(chǎn)量的最佳調(diào)價(jià)為pH=6，有研究認(rèn)為，偏酸時(shí)，H+可以與紅曲霉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，從可交換的結(jié)合物或細(xì)胞表面置換出某些陽(yáng)離子，使紅曲霉產(chǎn)生較多的色素；而當(dāng)pH偏堿時(shí)，水合氫離子和OH-能降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和細(xì)胞表面的電荷，從而降低產(chǎn)色。

[1]周立平.紅曲研究生產(chǎn)現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].釀酒科技，2003，（4）：34-35.

[2]方元超，楊 柳.紅曲霉研究進(jìn)展綜述[J].四川食品與發(fā)酵，1999，（1）：5-10.

[3]謝曉瓊，甘純璣.水溶性紅曲黃色素與2種天然黃色素的穩(wěn)定性比較[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，26（3）：378-381.

[4]王雅芬，傅華月.紅曲霉的有效生理活性物質(zhì)及應(yīng)用[J].杭州科技，2000，（5）：25-27.

[5]王偉平，吳思方.復(fù)合誘變紅曲霉選育紅色素高產(chǎn)菌株[J].湖北工學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，（8）：5-7.

[6]梁智嫦.高色價(jià)高穩(wěn)定性紅曲霉菌種的選育[J].食品科技，2000，（5）：35-36.

[7]王雅芬，袁康培.低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌種的選育研究[J].食品科學(xué)，2003，（8）：93-97.

[8]趙 華，趙樹(shù)欣，張 維，等.己酸乙酯高產(chǎn)菌的誘變選育[J].釀酒科技，1997，（3）：23-25.

[9]洪智勇，毛 寧.激光對(duì)紅曲霉的誘變作用[J].激光雜志，2002，（5）：53-54.

[10]Hajjaj H,Blance P J,Groussac E,et al.Improvement of Red Pigment Citrinin Production Ratio as a Function of Environmental Conditions by Monascus rubber[J].Biotechnology and Bioengineering,1999,64（4）:497-501.

[11]Han O，Mudgett R E.Effect of Oxygen and Carbon Dioxide Partial Pressure on Monascus Growth and Pigment Production in Solid-state Fermentation[J].Biotechnol，1992，（8）:5-10.

[12]許贛榮，李鳳琴，陳 蘊(yùn)，等.紅曲霉桔霉素的檢測(cè)方法及紅曲霉產(chǎn)桔霉素的判別方法[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（3）：16-20.

[13]毛 寧，陳細(xì)香，楊 青，等.紅曲霉產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，10（4）：80-84.

[14]Johns M R,Stuart D M.Production of Pigment by Monascus Purpureus in Solid Culture[J].Ind.Microbiol，1999，（8）：23-28.

[15]陳義光，彭德嬌，張曉蓉，等.pH對(duì)紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的影響[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（2）：147-149.

[16]Blance P J，Loret M O，Goma G.Production of Citrinin Various Species of Monascus[J].Biotechnology Letters，1995，17（3）：291-294.

[17]賴建平，羅 軍，曹強(qiáng)輝，等.紅曲色素生產(chǎn)菌的誘變篩選及培養(yǎng)[J].廣州大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，14（3）：46-50.

[18]石 鶴，周 毅.紅曲霉液體培養(yǎng)條件與產(chǎn)色的關(guān)系[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2004，25（3）：83-85.