分子印跡技術(shù)在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用

楊 鑫，張 華，董愛軍，張英春，趙海田，姚 磊，佘永新，王 靜

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081）

天然產(chǎn)物活性成分是指從植物、動(dòng)物、微生物和各種自然生物群落、森林、草原、水生生物等再生資源中提取的具有獨(dú)特功能和生物活性的化合物，其中許多有效成分是疾病防治、強(qiáng)身健體的物質(zhì)基礎(chǔ)。天然產(chǎn)物的活性成分復(fù)雜，既包括多糖、蛋白質(zhì)、多肽等大分子物質(zhì)，又包括黃酮、多酚、甾體、生物堿、萜類等小分子物質(zhì)，衡量天然產(chǎn)物研究和活性物質(zhì)的質(zhì)量很大程度上取決于有效成分提取分離的結(jié)果。天然產(chǎn)物有效成分分離純化的難點(diǎn)在于：天然產(chǎn)物的有效成分含量低，難于富集；體系復(fù)雜，大分子和小分子、生命和非生命物質(zhì)共存，特別是存在結(jié)構(gòu)相近的異構(gòu)體，導(dǎo)致分離純化難度大，提取純化工藝繁瑣費(fèi)時(shí)；此外，許多天然產(chǎn)物的有效成分穩(wěn)定性差，對(duì)熱敏感，易氧化、水解等。

分子印跡技術(shù)（Molecular imprinting technology,MIT）又稱為分子烙印技術(shù)，屬于高分子化學(xué)、材料科學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)等之間的一個(gè)交叉學(xué)科領(lǐng)域。分子印跡技術(shù)是為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合點(diǎn)位上與某一分子（通常稱為模板分子）完全匹配的聚合物的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。分子印跡聚合物（Molecular imprinting polymer，MIPs）是指以目標(biāo)分子為模板分子，將具有結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的功能化聚合物單體通過共價(jià)或非共價(jià)的方式與模板分子結(jié)合，加入交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)完成后將模板分子提取出來后形成的一種有固定空穴大小和形狀及有確定排列功能團(tuán)的交聯(lián)高聚物。分子印跡技術(shù)之所以發(fā)展如此迅速，主要是因?yàn)樗哂蓄A(yù)定性（Predetermination）、識(shí)別性（Recognition）和實(shí)用性（Practicability）。由于MIPs具有抗惡劣環(huán)境的能力，表現(xiàn)出穩(wěn)定性強(qiáng)和使用壽命長等優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)其合成及應(yīng)用研究十分活躍，涉及的范圍很廣，如手性物質(zhì)分離，生物傳感器，模擬抗體與受體，模擬酶催化，氨基酸及多肽等生物大分子、金屬離子、藥物分子、天然產(chǎn)物等的分離與純化。本文主要概述了MIPs的原理及其在天然產(chǎn)物有效成分的分離與純化方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1 分子印跡技術(shù)基本原理

在一定溶劑（也稱致孔劑）中，模板分子與功能單體依靠官能團(tuán)之間的共價(jià)或非共價(jià)作用形成主客體配合物；然后加入交聯(lián)劑，通過引發(fā)劑引發(fā)進(jìn)行光或熱聚合，使主客體配合物與交聯(lián)劑通過自由基共聚合在模板分子周圍形成高聯(lián)的剛性聚合物；最后將聚合物中的印跡分子洗脫或解離出來。這樣在聚合物中便留下了與模板分子大小和形狀相匹配的立體孔穴，同時(shí)孔穴中包含了精確排列的與模板分子官能團(tuán)互補(bǔ)的由功能單體提供的功能基團(tuán)，如果構(gòu)建合適，這種分子印跡聚合物就象鎖一樣對(duì)此鑰匙具有選擇性。這便賦予該聚合物特異的“記憶”功能，即類似生物自然的識(shí)別系統(tǒng)，這樣的空穴將對(duì)模板分子及其類似物具有選擇識(shí)別特性。分子印跡技術(shù)基本原理如圖1所示[1-2]。

2 分子印跡聚合物制備方法

2.1 本體聚合法

本體聚合法（Bulk polymerization）是目前最常用的，也是最經(jīng)典的一種方法。合成過程是將印跡分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按一定比例溶解在適當(dāng)?shù)娜軇w系中，然后置入具塞瓶中，超聲后充氮除氧，密封，通過熱聚合或光聚合一定時(shí)間，得到的塊狀聚合物，即為MIPs。然后經(jīng)粉碎、研磨、過篩獲得合適大小的微粒，再經(jīng)索氏提取洗脫除去模板分子，真空干燥后備用。本體聚合法對(duì)模板分子具有良好的選擇性和識(shí)別特性，其合成和操作條件易于控制，便于普及。但是，該法獲得的聚合物顆粒不均一、產(chǎn)量低；作為柱填料使用時(shí)，柱效低、分壓高，且吸附量不高；模板的除去困難，導(dǎo)致使用過程中模板滲漏[3]。

圖1 分子印跡技術(shù)原理Fig.1 Molecular imprinted technology

2.2 沉淀聚合法

沉淀聚合法（Precipitation polymerization）是近年來被廣泛采用合成分子印跡微球的一種方法，又稱非均相溶液聚合。在引發(fā)劑的作用下，反應(yīng)產(chǎn)生自由基引發(fā)聚合成線型、分支的低聚物，接著低聚物交聯(lián)成核從介質(zhì)中析出，相互聚集而形成聚合物粒子，這些聚合物粒子與低聚物及單體最終形成高交聯(lián)度的聚合物微球。沉淀聚合法實(shí)驗(yàn)過程簡單，無需研磨。但為避免團(tuán)聚，合成的微球通常只能在低粘度的溶劑中進(jìn)行，因此對(duì)溶劑的粘性要求較高[4-5]。

2.3 懸浮分散法

懸浮聚合法（Suspension polymerization）也是目前制備球型分子印跡聚合物的一種常用方法。近年來，許多學(xué)者利用各種新型分散劑制備分子印跡聚合物微球取得了新的進(jìn)展[6]，其反應(yīng)體系一般由單體、脂溶性引發(fā)劑、分散劑和水組成。合成過程是先用有機(jī)溶劑將單體溶解，加到溶有穩(wěn)定的水或其他強(qiáng)極性的溶劑中，高速攪拌獲得懸濁液，然后加入引發(fā)劑，引發(fā)聚合獲得分子印跡聚合物微球。盡管懸浮聚合方法獲得的聚合物吸附效果較好，但其制備過程較為復(fù)雜，通常需要昂貴的分散劑和惰性分散體系[7]。

2.4 表面印跡法

表面印跡聚合法（Surface imprinting ploymerization）起源于硅膠表面處理和衍生的方法，是一種在固體表面進(jìn)行分子印跡聚合的技術(shù)。合成過程是先將模板分子與功能單體在一定的有機(jī)溶劑中反應(yīng)形成加合物，然后將其與表面活化后的硅膠、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（TRIM）粒子和玻璃介質(zhì)反應(yīng)嫁接形成聚合物。表面印跡法解決了傳統(tǒng)方法中對(duì)模板分子包埋過深或過緊而無法洗脫下來的問題，形成的聚合物可以使底物更容易接近活性點(diǎn)。此外，該法即可改變載體樹脂的交聯(lián)度，也可調(diào)整孔結(jié)構(gòu)，得到小粒徑和窄分布的載體，因而可用于色譜柱中[8]。

3 分子印跡技術(shù)在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用

3.1 生物堿類活性成分的分離純化

生物堿一般指存在于生物體內(nèi)的堿性含氮化合物，多數(shù)具有復(fù)雜的含氮雜環(huán)，有堿性和顯著的生理活性。一些生物堿因具有抗腫瘤、抗癌、低毒、低成本的特點(diǎn)，最近已成為人們研究的焦點(diǎn)?？茖W(xué)、高效地從植物中提取和分離純化生物堿成分是擴(kuò)大其實(shí)際應(yīng)用的核心問題。近年來生物堿類活性成分的提取已成為分子印跡技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9]。

3.1.1 茶堿

Mosbach等在1993年首次利用藥物茶堿與甲基丙烯酸（MA）之間可氫鍵鍵合，制成了藥物茶堿分析用色譜固定相。由此方法已合成了對(duì)藥物、生物活性物質(zhì)、酶等有識(shí)別功能的樹脂、凝膠固定相等高分子材料，使分子烙印從最初的手性體分離材料制備和手性體分離這一單一應(yīng)用范圍迅速地?cái)U(kuò)展到化學(xué)、生物、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域[10]。Kobayashi等首次采用濕相轉(zhuǎn)化技術(shù)制備了茶堿的MIPs薄膜。這個(gè)薄膜是丙烯腈-丙烯酸的共聚物。吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該分子印跡膜為不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，包含一致密表層與一多孔支撐亞層，對(duì)茶堿的吸附量遠(yuǎn)大于咖啡因。這表明在相互轉(zhuǎn)化的過程中，MIPs記錄了茶堿分子的形狀。通過對(duì)薄膜的表征，發(fā)現(xiàn)了茶堿和共聚物間相互作用的證據(jù)[11]。王紅英等采用相轉(zhuǎn)化法制備具茶堿分子識(shí)別功能的（AN-CO-AA）高分子膜，對(duì)茶堿等有機(jī)堿有很高的立體選擇性。FT-IR及NMR測試結(jié)果表明，制備的高分子膜中，茶堿模板分子和膜中的丙烯酸功能殘基存在著良好的氫鍵鍵合作用[12]。王靖宇等采用自由基熱聚合法在PVDF中空纖維膜表面制備茶堿分子印跡膜，采用SEM測試手段對(duì)膜聚合前后的表面形貌進(jìn)行表征，證明分子印跡膜表面聚合層的存在，并將所得分子印跡膜及空白膜組裝成膜組件，以膜色譜形式應(yīng)用于茶堿和可可堿混合物的萃取分離，比較了相同條件下空白膜和印跡膜對(duì)茶堿和可可堿選擇性吸附性能，同時(shí)考察了不同濃度混合液和不同乙酸酸度的甲醇萃取液對(duì)過濾結(jié)果的影響。結(jié)果表明，印跡膜的選擇性因子隨混合液濃度和萃取液中乙酸含量的增加而降低[13]。

3.1.2 咖啡因

顏流水等采用分子印跡技術(shù)建立了一種新型高選擇性分離測定咖啡因的微柱液相色譜法。在該方法中，以咖啡因?yàn)槟０宸肿?，?jīng)紫外光引發(fā)原位聚合制備了分子印跡毛細(xì)管整體柱。考察了柱制備過程中影響柱性能的主要因素，優(yōu)化了色譜分離條件。結(jié)果顯示所制備的分子印跡整體柱對(duì)咖啡因具有高度選擇性，咖啡因與其結(jié)構(gòu)相似物的最高分離度為2.57。將這一方法用于測定綠茶飲料、百事可樂和復(fù)方藥片中咖啡因含量，獲得滿意結(jié)果[14]。陳移姣等以咖啡因?yàn)槟０宸肿?，采用水溶液懸浮聚合法制備了用于色譜分離（作HPLC的固定相）的微米級(jí)分子印跡聚合物微球（MIPMs）。結(jié)果表明當(dāng)以茶葉堿為競爭分子時(shí)，MIPMs對(duì)咖啡因有強(qiáng)的吸附和特異性選擇識(shí)別能力，能滿足茶葉中咖啡因分離富集的需要，這為在天然物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、藥效高的成分的鑒定分析和分離純化提供了方法借鑒[15]。

3.1.3 士的寧

張靜等以士的寧為模板分子，采用原位分子印跡技術(shù)，合成了士的寧分子印跡整體柱。通過優(yōu)化合成條件，確定了模板分子、功能單體與交聯(lián)劑之間的比例以1∶4∶16最佳；對(duì)士的寧整體柱的色譜條件包括流動(dòng)相組成、流速、柱溫等進(jìn)行了考察，并用于士的寧和馬錢子堿的分離，其分離因子為3.5[16]。

3.1.4 奎寧

張春靜等采用多孔醋酸纖維膜為支撐體，制備了奎寧分子印跡復(fù)合膜，并對(duì)膜的選擇結(jié)合性及分離性能進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，奎寧分子印跡復(fù)合膜對(duì)模板分子奎寧具有較好的選擇結(jié)合性，奎寧在膜上結(jié)合量達(dá)到20.6 μmol·g-1，奎寧/辛可寧的分離因子則為5.6；膜透過實(shí)驗(yàn)表明辛可寧透過奎寧分子印跡復(fù)合膜速率遠(yuǎn)大于奎寧的透過速率，該透過機(jī)理符合膜滲透的“溶解-擴(kuò)散”模型[17]。何建峰等也以奎寧分子為模板，甲基丙烯酸為功能單體，在親水體系中利用兩步種子溶脹和微乳液聚合的分子印跡技術(shù)，成功制備得到一種單分散性好的球形分子印跡聚合物。用紅外光譜、熱重分析、電鏡掃描、粒度分析等技術(shù)對(duì)聚合物進(jìn)行了表征。通過聚合物在不同溶劑中的吸附量的變化，揭示采用酸性的功能單體MAA制得的聚合物可與帶胺基的模板分子通過氫鍵、離子鍵（靜電）相互作用，且識(shí)別機(jī)理隨溶劑類型改變而改變。對(duì)不同底物的選擇性實(shí)驗(yàn)表明該聚合物對(duì)模板分子具有良好的識(shí)別能力和選擇性[18]。

3.1.5 苦參

Lai等以苦參堿為模板制作了分子印跡膜，從槐屬植物苦參中提取分離苦參堿。結(jié)果分子印跡膜對(duì)苦參堿的回收率可達(dá)到71.4%[19]。以上研究結(jié)果表明，分子印跡膜的最大特點(diǎn)就是對(duì)模板分子的識(shí)別具有可預(yù)見性，對(duì)于特定物質(zhì)的分離極具針對(duì)性。其中分子印跡復(fù)合膜又將膜分離的可連續(xù)化操作特點(diǎn)與分子印跡技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，是最有應(yīng)用前景的一種膜技術(shù)。

3.2 黃酮類活性成分的分離純化

黃酮類化合物是在植物中分布非常廣泛的一類天然產(chǎn)物，其在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類，有一部分是以游離態(tài)的形式存在。絕大多數(shù)的植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，其對(duì)植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果及防菌防病等方面起著重要的作用。同時(shí)，黃酮類化合物分布廣泛，生理活性多種多樣，如槲皮素、蘆丁、葛根素等具有擴(kuò)冠活性，牡荊素、漢黃岑素等具有抗腫瘤活性等，因此引起了人們的廣泛研究。而近年來，黃酮類化合物的研究已傾向于其藥用價(jià)值的開發(fā)，更多地涉及了提取分離工藝的應(yīng)用研究、黃酮類化合物的含量測定及制劑等[20-21]。

3.2.1 葛根素

程紹玲等以葛根素為模板分子，丙烯酰胺為單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，制備了葛根素的MIPs。該MIPs對(duì)葛根異黃酮有很好的印跡作用，可有效地從葛根提取物中分離出葛根素、大豆苷元和大豆苷。該研究為葛根有效成分的分離提供了一種新的方法[22]。

3.2.2 槲皮素

謝建春等采用非共價(jià)法，在極性溶劑中，以丙烯酰胺為功能單體，以強(qiáng)極性化合物槲皮素為模板，制備了MIPs。液相色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該MIPs對(duì)槲皮素具有特異的親和性，將此MIPs直接用于銀杏葉提取物水解液的分離，得到主要含模板槲皮素及與槲皮素結(jié)構(gòu)相似的化合物山柰酚兩種黃酮類組分[23]。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，謝建春等以槲皮素為模板，在四氫呋喃中采用非共價(jià)鍵法制備了MIPs，從沙棘粗提物中分離得到了治療心血管疾病的主要活性成分槲皮素和異鼠李素[24]。此外，Theodoridis等合成了可選擇性吸附蘆丁和槲皮素的MIPs，在印跡過程中，以這兩種類黃酮為模板分子，通過非共價(jià)方法制備MIPs。通過液相色譜和固相萃取研究證實(shí)，合成的MIPs具有印跡效果，從紅酒、白酒、橙汁和茶中預(yù)富集了類黃酮組分[25]。顏流水等通過分子印跡技術(shù)，利用熱聚的方法，以槲皮素為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，成功地合成了槲皮素MIPs[26]。該MIPs對(duì)槲皮素有很高的親和性。

3.2.3 蘆丁

張?jiān)Ｇ涞壤梅肿佑≯E技術(shù)，以水溶性黃酮蘆丁為模板劑與具有專一識(shí)別官能團(tuán)的氯丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)制備出前驅(qū)物，然后將前驅(qū)物與正硅酸乙酯進(jìn)行協(xié)同水解、凝膠老化和模板劑的洗脫，從而制備出對(duì)蘆丁具有高效選擇性的內(nèi)置型硅質(zhì)吸附劑。結(jié)果表明，該吸附劑具有較高的吸附容量，即使在有與蘆丁結(jié)構(gòu)相似的黃酮存在下，對(duì)蘆丁依然有較高的選擇性吸附能力；TEM照片表明該吸附劑具有與印跡分子相匹配的納米孔洞，而對(duì)FTIR光譜分析表明該吸附劑在印跡識(shí)別過程有新的化學(xué)鍵生成[27]。

3.2.4 非瑟酮

非瑟酮是中藥黃櫨的主要組成成分，屬于天然類黃酮物質(zhì)，具有抗炎、抗菌作用。李禮等以中約黃櫨的主要成分非瑟酮為印跡分子、丙烯酰胺為功能單體及乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，通過封管聚合法合成了分子印跡填充膜；通過優(yōu)化清洗及洗脫條件，用固相萃取使非瑟酮與它的結(jié)構(gòu)相似物槲皮素在柱上得到了很好的分離[28]。

3.2.5 山奈酚

賀敏強(qiáng)等采用分子印跡技術(shù)，以山奈酚（Kaempferol，KAE）為模板分子，2-乙烯基吡啶（2-Vpy）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，合成了山奈酚分子印跡聚合物（KAE-MIP）。采用靜態(tài)平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了KAE-MIP對(duì)底物分子的結(jié)合特性，并進(jìn)行了吸附動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明，KAE-MIP對(duì)KAE呈現(xiàn)出很強(qiáng)的選擇吸附特性；Scatchard分析顯示KAE-MIP對(duì)KAE存在不同親和力的兩類結(jié)合位點(diǎn)；與對(duì)照物在KAE-MIP上的吸附行為比較表明，KAE-MIP對(duì)KAE具有良好的分子識(shí)別性能；KAE-MIP對(duì)KAE的選擇性吸附基本在2 h之內(nèi)完成[29]。

3.2.6 木犀草素

肖淑娟等采用分子印跡技術(shù)，以木犀草素為模板分子、丙烯酰胺為功能單體、EGDMA為交聯(lián)劑，合成了木犀草素印跡聚合物。將該印跡聚合物用于固相萃取，分離提取花生殼中的木犀草素。結(jié)果表明，該印跡聚合物對(duì)木犀草素具有較強(qiáng)的吸附性能和選擇性，用印跡柱萃取得到的木犀草素純度高出硅膠柱分離近20個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)到96.2%。且MIPs-SPE柱與普通的硅膠柱相比，經(jīng)過洗脫再生后可以反復(fù)使用多次[30]。

3.3 多元酚類活性成分的分離純化

3.3.1 柯里拉京

柯里拉京（Corilagin）亦稱為云實(shí)精，是一種具有抗纖溶活性、抗腫瘤以及抑制乙肝病毒作用的天然多酚類化合物，是葉下珠、老鸛草、蜜柑草等植物中的有效成分[31]。袁小紅等以柯里拉京為模板分子，采用本體聚合法，合成了對(duì)柯里拉京分子具有高選擇性的分子印跡聚合物，對(duì)其分子識(shí)別能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明，以丙烯酰胺為功能單體得到的聚合物對(duì)模板分子柯里拉京的分子印跡效率高[32]。這為進(jìn)一步研究以該分子印跡聚合物為萃取材料，富集、萃取、分離復(fù)雜中藥體系中的柯里拉京及其結(jié)構(gòu)類似物提供了重要的手段。

3.3.2 茶多酚

茶多酚中的兒茶素類成分結(jié)構(gòu)相似，尤其是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和其對(duì)映體沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG），用常規(guī)方法難以分離。鐘世安等以EGCG為模板分子，α-甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，在光冷引發(fā)條件下合成了EGCG的MIPs；利用該MIPs制備了固相萃取柱，并用于提取茶葉中的茶多酚。他們還對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在萃取柱上載樣品之后，先用甲醇一水（體積比為1∶9）混合液進(jìn)行清洗，再用甲醇一乙酸（體積比為9:1）混合液進(jìn)行目標(biāo)分子的洗脫，可以得到比較純（92.4%）的目標(biāo)物EGCG，該提取步驟中EGCG的回收率達(dá)到了69.3%。分子印跡柱具有較好的穩(wěn)定性和耐用性能，使用20次后其選擇性識(shí)別能力仍未降低，但空白印跡柱卻沒有這樣的選擇性識(shí)別能力[33]。

3.3.3 白藜蘆醇

白藜蘆醇具有明顯的抗菌、抗炎、抗血栓、抗高血脂等作用，對(duì)心血管病有明顯的療效[34]。向海艷等采用分子印跡技術(shù)，以白藜蘆醇為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，合成了對(duì)天然活性物質(zhì)白藜蘆醇具有較好選擇性的印跡聚合物。通過靜態(tài)平衡結(jié)合法以及Scatchard分析法研究了該聚合物的結(jié)合能力和選擇性能。結(jié)果表明，該印跡聚合物中形成了兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)，其離解常數(shù)分別為 9.9×10-5moL·L-1和 1.7×10-3mol·L-1。與化學(xué)組成相同的相應(yīng)非印跡聚合物相比，白藜蘆醇分子印跡聚合物對(duì)白藜蘆醇有較強(qiáng)的吸附性能和選擇性。將該印跡聚合物用于分離中藥虎杖提取液中的白藜蘆醇，得到良好的效果[35]。洪美花等以聚苯乙烯微球?yàn)榉N球，白藜蘆醇為模板分子，采用單步溶脹聚合法在N，N-二甲基甲酰胺體系中制備了單分散分子印跡聚合物微球。用掃描電鏡對(duì)微球的結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了表征，并研究了微球的制備條件和吸附特性。微球的凹陷可有效地增加微球的比表面積和結(jié)合位點(diǎn)，從而提高了模板分子的結(jié)合速率及微球的印跡容量[36]。

3.3.4 和厚樸酚

王婧等采用單步溶脹聚合法制備了和厚樸酚分子印跡聚合物微球（MIPMs）。Scatchard分析表明分子印跡聚合物微球在識(shí)別和厚樸酚分子的過程中存在兩類結(jié)合位點(diǎn)，其高親和位點(diǎn)的解離常數(shù)為KD1=0.13 mmol·L-1，最大表觀結(jié)合量Qmax=45.21 μmol·g-1。靜態(tài)吸附試驗(yàn)證明MIPMs對(duì)模板分子具有較強(qiáng)的特異吸附能力，以厚樸酚為競爭底物，其分離因子達(dá)1.85[37]。

3.4 甾體類類活性成分的分離純化

甾體類化合物的結(jié)構(gòu)相似，其物理、化學(xué)性質(zhì)非常接近，采用一般的化學(xué)方法很難對(duì)其中某一組分進(jìn)行分離純化和定量測定。甾體分子大多含有一個(gè)剛性骨架和羥基取代基，因而可利用羥基和功能單體形成氫鍵或酯鍵制備相應(yīng)的MIPs，使之得到高效的分離[38]。近年來用MIPs提取甾類分子已引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，其中應(yīng)用最廣泛的是人體內(nèi)的一些活性物質(zhì)，如膽固醇、睪丸激素、皮質(zhì)醇等的提取。采用非共價(jià)鍵法Ramstrtim等首次制備了皮質(zhì)醇分子印跡體系，但是聚合物對(duì)皮質(zhì)醇的選擇性較低[39]。針對(duì)上述問題，Baggiani等研究了聚合物對(duì)皮質(zhì)醇的吸附和選擇性能，發(fā)現(xiàn)以皮質(zhì)醇為印跡分子的MIPs對(duì)目標(biāo)分子顯示了良好的選擇性，可以明顯的和其他結(jié)構(gòu)類似的化合物區(qū)分開來[40]。Sreenivasan等采用非共價(jià)鍵法，利用極性不同的兩種單體制備了膽固醇和睪丸激素的分子印跡聚合物。研究了不同極性聚合物對(duì)膽固醇和睪丸激素的選擇性和吸附量，結(jié)果顯示極性小的單體聚合物對(duì)膽固醇具有較大的吸附量，反之，對(duì)睪丸激素具有較大的吸附量[41]。采用共價(jià)鍵方法Kugimiya等利用p-2-乙烯基苯硼酸和油菜素甾酮中的兩組順式羥基發(fā)生酯化作用，制備了植物甾族激素油菜素甾酮的分子印跡聚合物[42]。雖然共價(jià)鍵方法的制備過程比較復(fù)雜，但是該法所得的MIPs對(duì)模板具有很強(qiáng)的選擇性吸附，能夠避免同樣具有順式羥基的雌激素三醇等成分的干擾。

3.5 萜類活性成分的分離純化

齊墩果烷是白色針晶，屬于三萜類化合物，具有護(hù)肝降酶、抗炎、強(qiáng)心利尿、抗腫瘤等藥效，但是采用常規(guī)的提取分離方法對(duì)其提取效率不高[43]。Claude等用齊墩果烷三萜化合物為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，氯仿為致孔溶劑，通過熱聚法合成了MIPs，其印跡效果顯著，對(duì)齊墩果烷三萜的吸附容量為0.94 mg·g-1。四個(gè)結(jié)構(gòu)相似的齊墩果烷三萜化合物被用于評(píng)價(jià)該MIPs的選擇性，結(jié)果表明三萜骨架上官能團(tuán)的影響很顯著。用該MIPs可以從甘草根中提取18-β-glycyrrhetinicacid，且收率達(dá)到了98%[44]。

3.6 對(duì)手性異構(gòu)體及結(jié)構(gòu)類似物的分離

3.6.1 辛可寧

黃曉冬等采用原位聚合的方法直接在毛細(xì)管柱中合成出辛可寧印跡聚合物。該聚合物與毛細(xì)管內(nèi)壁共價(jià)結(jié)合連為一體形成整體式毛細(xì)管柱，掃描電鏡顯示其具有較大的流通孔結(jié)構(gòu)。采用壓力輔助毛細(xì)管電色譜模式拆分了非對(duì)映異構(gòu)體抗瘧藥物辛可寧和辛可尼丁，柱效遠(yuǎn)高于其在高效液相色譜分離中的柱效?？疾炝穗妷?、外壓、溫度、流動(dòng)相表現(xiàn)pH和乙腈含量對(duì)分離結(jié)果的影響。通過條件優(yōu)化，可以在2 min內(nèi)完成辛可寧和辛可尼丁的快速分離[45]。

3.6.2 偽麻黃堿

Beach等以(-)-偽麻黃堿和(-)降麻黃堿為模板，制得MIM作為薄層色譜的手性固定相，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)相應(yīng)模板分子的識(shí)別，而且還能分離出結(jié)構(gòu)類似的手性化合物麻黃堿和副腎堿[46]。由此看出，以活性成分為模板分子合成相應(yīng)的MIM，可直接從中藥中分離與模板分子結(jié)構(gòu)類似、生理活性相似的成分，避免了傳統(tǒng)分離的低效性。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床藥物的手性分離和分析。研究的分離對(duì)象包括藥物、氨基酸及衍生物、肽及有機(jī)酸等。

3.7 在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

分子印跡聚合物用作傳感器的敏感材料是分子印跡技術(shù)的一個(gè)重要方面。分子印跡聚合物敏感材料與近年來研究較熱的生物敏感材料相比，具有耐高溫、高壓、酸、堿和有機(jī)溶劑，不易被生物降解破壞，可多次重復(fù)使用，易于保存等優(yōu)點(diǎn)，且較生物材料易得，可用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成。因此其膜適合作為靈敏度較高的傳感器，目前已被用作傳感器的敏感部件，用于識(shí)別氨基酸[47-48]、除草劑[49-50]、神經(jīng)毒劑[51-52]等多種物質(zhì)。

4 結(jié)語與展望

天然產(chǎn)物是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，如何從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中提取和分離出有效成分，是當(dāng)前加快天然產(chǎn)物現(xiàn)代化進(jìn)程的一個(gè)重要問題。但是，目前天然產(chǎn)物的分離純化仍然是一項(xiàng)相對(duì)繁瑣、耗時(shí)的工作。當(dāng)一個(gè)具有開發(fā)價(jià)值的天然化合物被發(fā)現(xiàn)之后，如何能找到一種高效且低成本的分離方法便成為關(guān)鍵。MIT作為中藥活性成分提取的一種新技術(shù)，其最大特點(diǎn)是用已知的化合物為印跡分子，合成化合物的印跡聚合物，對(duì)中藥提取液進(jìn)行高通量篩選，再結(jié)合色譜等進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)[53-54]。雖然MIT已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域并取得了顯著成果。但作為一種新型的分離技術(shù)，其本身在理論和應(yīng)用等方面還存在許多有待解決的問題。首先，分子印跡技術(shù)的機(jī)理研究相對(duì)膚淺，還處于定性和半定量的階段，結(jié)合位點(diǎn)的作用機(jī)理、聚合物的形態(tài)和傳質(zhì)機(jī)理不夠明確，需進(jìn)一步從分子水平上弄清楚分子印跡和識(shí)別的過程，定量描述其機(jī)理，以提高M(jìn)IPs制備的預(yù)知性和可控性。其次，目前MIPs的制備和應(yīng)用大多數(shù)只能在有機(jī)相中進(jìn)行，如何利用特殊的分子間作用力在水溶液中或極性溶液中進(jìn)行分子印跡以便接近或達(dá)到天然分子識(shí)別系統(tǒng)水平，將分子印跡和識(shí)別過程從親脂性藥物拓展到親水性藥物尚待研究。第三，目前功能單體的種類太少，且價(jià)格昂貴，不能滿足某些分子的識(shí)別要求，更不能滿足其實(shí)際生產(chǎn)的需要，新的功能單體的合成迫在眉睫。第四，現(xiàn)在所用的模板分子多為酸性或堿性的小分子苷元，如何將分子印跡研究領(lǐng)域從目前的小分子領(lǐng)域拓展到諸如蛋白、核酸、多糖等大分子領(lǐng)域，甚至拓展到超分子水平的細(xì)胞與病毒，對(duì)分子印跡技術(shù)來說具有里程碑意義。

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