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    胞磷膽堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

    2011-07-08 01:02:06丁細(xì)桃李軍偉張立康邱相君
    食管疾病 2011年2期
    關(guān)鍵詞:胞磷藥代膽堿

    丁細(xì)桃,李軍偉,張立康,邱相君

    胞磷膽堿為膽堿胞嘧啶核苷二磷酸酯,是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)性磷脂生物合成過程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)。吸收后在體內(nèi)廣泛分布,并透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。通過降低腦血管阻力,增加腦血流而促進(jìn)腦物質(zhì)代謝,改善腦循環(huán)。對于認(rèn)知障礙、記憶缺失和早期阿爾茨海默病的病人有良好的臨床療效,對促進(jìn)大腦功能的恢復(fù)和促進(jìn)蘇醒有一定作用[1],是目前治療卒中最為看好的神經(jīng)保護(hù)劑之一[2]。目前,胞磷膽堿已廣泛應(yīng)用于缺血性卒中、腦外傷和認(rèn)知障礙的治療,其在腦出血、帕金森病和青光眼等疾病中的治療應(yīng)用也日益受到重視[3]。

    國內(nèi)關(guān)于血漿中胞磷膽堿檢測和藥代動(dòng)力學(xué)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)首先建立了檢測兔血漿胞磷膽堿濃度的高效液相色譜檢測方法,并在此基礎(chǔ)上研究了胞磷膽堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。

    1 材料與方法

    1.1 儀器 高效液相色譜儀為Agilent1100 系列,包括G1379A 在線脫氣機(jī),G1311A 四元泵,G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A 溫控箱,G1315B 二極管陣列檢測器,和Agilent 化學(xué)工作站(Rev A.10.02.[1757])。電子分析天平(AB204-A,梅特勒-托利多上海儀器公司);渦旋混合器(XK96-B,姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);高速冷凍離心機(jī)(TGL-16,上海安亭科學(xué)儀器廠)。

    1.2 試劑和藥品 甲醇和乙腈為一級色譜純,三氟乙酸(Sigma,064K3647),高氯酸為優(yōu)級純,十二烷基硫酸鈉(SDS)為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。胞磷膽堿(140675-200803)、安替比林標(biāo)準(zhǔn)品(100506-200301)均購自中國藥品生物制品檢定所。胞磷膽堿注射液(091010),上海福達(dá)制藥有限公司。

    1.3 溶液配制

    1.3.1 對照品配制 準(zhǔn)確稱取胞磷膽堿標(biāo)準(zhǔn)對照品25 mg 于25 mL 容量瓶中,用甲醇溶解定容至25 mL,得濃度為1 g/L 的胞磷膽堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用甲醇稀釋成濃度依次為100、10、1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用時(shí)稀釋)。

    1.3.2 0.1%三氟乙酸(TFA)溶液 準(zhǔn)確吸取三氟乙酸1 mL,用純凈水稀釋并定容至1 L;0.45 μm 濾膜過濾后使用。

    1.3.3 10 mmol·L-1十二烷基磺酸鈉(SDS) 準(zhǔn)確稱取SDS 2.884 g,用純凈水溶解后,于1 000 mL 容量瓶中用純凈水定容,得濃度為10 mmol/L SDS 溶液。0.45 μm 濾膜過濾后使用。

    1.4 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18(4.6 ×150 mm,5.0 μm,USA);保護(hù)柱:TC-C18保護(hù)柱(4.6 ×12.5mm,5 μm,USA);流動(dòng)相:乙腈-水- 10 mmol/L SDS-0. 1%TFA =10:50:20:20(V/V/V/V);流速:0.8 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:282 nm。

    1.5 血漿樣品處理方法 準(zhǔn)確吸取待測血漿樣品0.3 mL 于1.5 mL EP 管中,加入100 mg/L 安替比林內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液20 μL,再加入35%高氯酸30 μL,漩渦振蕩20 s 后,12 000 r/min 離心10 min。取上清液于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中,設(shè)定5 μL 進(jìn)樣檢測。

    1.6 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 6 只雄性家兔由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量2.0 ~2.5 kg,禁食12 h后用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。胞磷膽堿注射液用純凈水稀釋成濃度為10 mg/mL。每只動(dòng)物按照10 mg/kg的劑量灌胃給予胞磷膽堿,2 h 后禁食不禁水。分別在給藥前和給藥后0.33,0.67,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6 h 耳緣靜脈采血1.0 mL 于肝素化試管中。3 000 r/min 離心10 min 后分離血漿,-80℃保存待檢。用上述方法檢測血漿胞磷膽堿濃度,用DAS 2.0 程序計(jì)算姜黃素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 HPLC 圖譜 血漿中胞磷膽堿峰形良好,分離完全,無雜質(zhì)峰干擾。胞磷膽堿保留時(shí)間為5. 2 min,內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為6.5 min 。

    2.2 線性關(guān)系及定量下限 配成濃度相當(dāng)于0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg/L 的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按“1.5”項(xiàng)方法處理后檢測,測定胞磷膽堿峰面積As、內(nèi)標(biāo)峰面積Ai,以As/Ai為縱坐標(biāo)(y),以所對應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。胞磷膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y =0.2902x-0.0015(r =0.9998)。定量下限為0.25 mg/L(n=6,RSD=6.52%)。

    2.3 回收率試驗(yàn)

    2.3.1 相對回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,平行6 組,再按“1.5”項(xiàng)方法處理。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的濃度,計(jì)算相對回收率(結(jié)果見表1)。

    表1 血漿胞磷膽堿的回收率結(jié)果(n=6,±s)

    表1 血漿胞磷膽堿的回收率結(jié)果(n=6,±s)

    加入量(mg/L) 檢測量(mg/L) 相對回收率(%) RSD(%) 絕對回收率(%) RSD(%)0.50 0.51 ±0.02 101.47 ±4.53 4.47 80.96 ±1.94 2.39 10.00 10.05 ±0.42 100.52 ±4.19 4.17 81.31 ±1.56 1.92 30.00 30.07 ±0.91 100.22 ±3.02 3.02 82.19 ±0.8 4 1.02

    2.3.2 絕對回收率試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,平行6 組,再按“1.5”項(xiàng)方法處理后測定,計(jì)算胞磷膽堿的峰面積,為血漿標(biāo)準(zhǔn)峰面積。另配制濃度為0.50、10.00、30.00 mg/L 的胞磷膽堿純標(biāo)準(zhǔn)品溶液,直接5 μL 進(jìn)樣檢測,記錄胞磷膽堿的峰面積,為該濃度的純對照品的峰面積。計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積與純標(biāo)的峰面積的比值,即為絕對回收率(結(jié)果見表1)。

    2.4 精密度試驗(yàn) 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,平行6 組,再按“1.5”項(xiàng)方法處理后于同一日內(nèi)測定,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d 內(nèi)測定,計(jì)算日間精密度(結(jié)果見表2)。

    表2 血漿胞磷膽堿的精密度結(jié)果(n=6,±s)

    表2 血漿胞磷膽堿的精密度結(jié)果(n=6,±s)

    加入量(mg/L)日內(nèi)(mg/L)RSD(%)日間(mg/L)RSD(%)0.50 0.50 ±0.02 4.03 0.50 ±0.02 4.38 10.00 10.13 ±0.29 2.86 10.17 ±0.34 3.36 30.00 30.19 ±0.84 2.77 30.18 ±0.86 2.85

    2.5 樣品穩(wěn)定性

    2.5.1 凍融條件下血漿樣品的穩(wěn)定性 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度3 份。經(jīng)歷3 次冰凍-解凍循環(huán)后,各取0.3 mL 檢測。3 個(gè)濃度的RSD 分別為6.49%、5.28%、2.86%,結(jié)果顯示凍融條件對血漿樣品的檢測結(jié)果沒有明顯的影響。

    2.5.2 冰凍保存血漿樣品的穩(wěn)定性 配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度的胞磷膽堿血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)濃度3 份,在-80℃冰箱冰凍保存4 周后,各取0.3 mL 檢測。3 個(gè)濃度的RSD 分別為7.03%、3.48%、1.54%,說明血漿樣品在冰凍保存的條件下有很好的穩(wěn)定性。

    2.6 血藥濃度-時(shí)間曲線 6 只家兔按10 mg/kg的劑量灌胃給予胞磷膽堿后,用該HPLC 法測得不同時(shí)間胞磷膽堿平均藥物濃度-時(shí)間曲線見圖1。

    2.7 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 血漿藥物濃度經(jīng)DAS 2.0程序處理,用房室模型估算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);根據(jù)F檢驗(yàn)、AIC 值和擬合優(yōu)度值R2,選擇最優(yōu)房室模型和權(quán)重,認(rèn)為該藥在家兔體內(nèi)符合一室模型,權(quán)重1/c2,并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用DAS2.0 計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下結(jié)果見表3。胞磷膽堿在兔體內(nèi)符合一級消除的一室模型。

    圖1 單劑量注射10 mg/kg 胞磷膽堿后的平均血漿藥-時(shí)曲線(n=6)

    表3 6 只家兔單劑量注射10 mg/kg胞磷膽堿的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    3 討論

    胞磷膽堿的極性很強(qiáng),易溶于水和甲醇。在反相C18 色譜柱中不易保留,在制劑和血漿檢測中,流動(dòng)相采用水相[4,5],需要特殊的水相柱。本研究在流動(dòng)相中加入十二烷基磺酸鈉(SDS)使其保留時(shí)間延長,在流動(dòng)相中增加了有機(jī)成分,可以減少水相對色譜柱的損傷,普通色譜柱就能很好地出峰。采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法對血漿進(jìn)行前處理,處理方法簡單、專屬性高、分離完全、成本較低廉;檢測時(shí)間短,7.0 min 能完成一個(gè)樣品的檢測,特別適合大批量樣品的自動(dòng)化檢測工作;方法回收率高,日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于10%,符合藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。適于化學(xué)藥物分析和臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究,結(jié)果可靠。

    胞磷膽堿是一種生物利用度超過90%的水溶性化合物。外源性胞磷膽堿進(jìn)入體內(nèi)后,很快分解為膽堿和胞苷,它們穿過血腦屏障,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重新合成胞磷膽堿[6]。在健康志愿者中,膽堿和胞苷水平在注射后30 min 達(dá)峰值,并且其循環(huán)濃度在此后6 h 持續(xù)增高。口服胞磷膽堿能被迅速而完全地吸收,在腸壁內(nèi)被水解為膽堿和胞苷,它們進(jìn)入各種利用胞磷膽堿作為介質(zhì)的生物合成通路,與靜脈注射胞磷膽堿具有相同的生物利用度和相似的藥代動(dòng)力學(xué)特征[6]。放射性示蹤劑研究表明,胞磷膽堿主要通過呼出CO2和尿液排泄,CO2和尿液消除的半衰期分別為51 h 和71 h[7]。大鼠口服給予胞磷膽堿后,血漿中膽堿和胞苷水平持續(xù)升高4 ~6 h。持續(xù)給予42 ~90 d 后,腦細(xì)胞膜3 個(gè)主要的磷脂—磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸升高[1]。

    本研究先建立高效液相色譜法檢測兔血漿胞磷膽堿濃度,研究了胞磷膽堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果顯示:6 只雄性家兔單劑量口服給藥胞磷膽堿后,胞磷膽堿在1.08 h 到達(dá)18.79 mg/L 的峰值濃度,血漿消除半衰期為1.03 h;在兔體內(nèi)符合一級消除的一室模型,與靜脈給藥的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本一致[5]

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