癌胚抗原化學(xué)發(fā)光免疫定量分析方法的建立

馮艷銘，夏曉燕，潘新娟，宋 琳

癌胚抗原(CEA)為最常用的腫瘤標(biāo)志物之一，癌胚抗原最初發(fā)現(xiàn)于成人結(jié)腸癌組織中，1965 年由Gold 首先報(bào)道。CEA 是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的可溶性糖蛋白，分子量約為200 000，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟，出生后組織內(nèi)含量很低;胃腸道惡性腫瘤時(shí)可見血清CEA 升高，在乳腺癌肺癌及其他惡性腫瘤患者的血清中也有升高;因此，CEA 是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標(biāo)，但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)等方面，仍有重要臨床價(jià)值。血清CEA 升高主要見于結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等，其他惡性腫瘤也有不同程度的高表達(dá)。CEA 連續(xù)隨訪檢測(cè)，可用于惡性腫瘤手術(shù)后的療效觀察及預(yù)后判斷，也可用于對(duì)化療病人的療效評(píng)價(jià)。一般情況下，病情好轉(zhuǎn)時(shí)血清CEA 濃度下降，病情惡化時(shí)升高。腸道憩室炎、直腸息肉、結(jié)腸炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但陽(yáng)性的百分率較低。另外，98%的非吸煙健康人血清CEA ＜5 μg/L，吸煙者中約有3.9%的人CEA＞5 μg/L。正常人血清CEA 含量在0 ～5 μg/L 之間，CEA 正常值一般低于5 μg/L。本文根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法的原理建立并研制了癌胚抗原化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒［1］，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 抗CEA 單抗腹水購(gòu)自O(shè)EM公司;CEA 多克隆抗體為自制;CEA 純品抗原購(gòu)自Fitzgeral 公司;堿性磷酸酶(ALP)由華美生物工程公司提供;化學(xué)發(fā)光底物CSPD及增強(qiáng)劑SapphireII 購(gòu)自PE 公司;過碘酸鈉(NaIO4)、硼氫化鈉(NaBH4)、乙二醇、2，4－二硝基氟苯(DNFB)均購(gòu)自Sigma 公司;Sephadex G－200 凝膠柱層析購(gòu)自LKB 公司，DE－52 離子交換柱購(gòu)自Sigma 公司，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板購(gòu)自深圳金燦華;Luminescent 化學(xué)發(fā)光儀(芬蘭雷勃);洗板機(jī)(Bio-Rad);CEA 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 標(biāo)本來(lái)源 標(biāo)本均為血清，清亮無(wú)溶血，－20℃凍存。分別為健康體檢門診的成年男性200份，成年女性(非妊娠女性)200 份，青少年200 份，老年人標(biāo)本200 份，其中男女比例為1∶1;臨床標(biāo)本100 份為陜西省人民醫(yī)院放免科采集的腫瘤或疑似患者血清。

1.3 方法

1.3.1 CEA 單克隆抗體的純化 抗CEA 單抗腹水用500 g/L 的飽和硫酸銨沉淀，再溶解透析后DE－52 換柱純化，分部收集，測(cè)定蛋白濃度。蛋白濃度應(yīng)在4 ～10 g/L 之間，無(wú)菌過濾，加1g/L NaN3后分裝，－20℃存放。

1.3.2 CEA 多抗血清制備與純化 純品CEA 免疫健康雄性山羊，首次劑量0.5 mg/只。4 周后加強(qiáng)免疫，劑量減半，共加強(qiáng)免疫3 次。耳靜脈采血測(cè)定效價(jià)，雙擴(kuò)散效價(jià)＞1∶128 的羊，進(jìn)行心臟采血，分離血清，羊抗CEA 血清按照1.3.1 方法進(jìn)行純化。

1.3.3 堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的制備 采用改良過碘酸鈉－乙二醇法［2，3］進(jìn)行標(biāo)記，將獲得的IgG-ALP用含100 g/L 小牛血清的0.05 mol/L (pH7.6)TBS緩沖液按1∶1000 稀釋成工作液，保存于－20℃。

1.3.4 CEA 校準(zhǔn)品制備 用系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定CEA 純品抗原后，用CEA 校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成含量分別為0、2.5、10、40、160、640 ng/mL 系列濃度，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品做定量曲線進(jìn)行校準(zhǔn)品濃度測(cè)定、相關(guān)性分析，建立定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的優(yōu)化 由不同濃度的SapphireII 增強(qiáng)劑和CSPD 組成底物工作液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光值(RLU)測(cè)定，進(jìn)行底物工作液的優(yōu)化。

1.3.6 固相化抗體微孔板的制備 將抗CEA 單抗用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋成2.0、5.0、8. 0、10. 0、13. 0、15. 0 μg/mL 的包被濃度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含1%酪蛋白的0.01 mol/L PBS(pH7.4)37℃封閉2 h后晾干備用［4］，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度。

1.3.7 正常人參考血清的確定 用優(yōu)化好的CEA化學(xué)發(fā)光定量試劑對(duì)800 份健康人標(biāo)本進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算+1.64s，確定血清醫(yī)學(xué)參考值范圍。

1.3.8 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè) 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品于相應(yīng)孔分別加25 μL 后，每孔再各加抗CEA-ALP 75 μL，在振蕩器上混勻1 min，置37℃恒溫反應(yīng)60 min。洗掉游離成分，加入底物工作液50 μL，ALP 催化底物脫磷酸酯，并發(fā)出463 nm 的可見光，第10 分鐘后測(cè)定各加樣品孔的發(fā)光值RLU，并將數(shù)據(jù)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀定量軟件Luminoskan ascent version 2.4.1 進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 底物工作液的優(yōu)化 CSPD 濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L，SapphireII 濃度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.25 g/L，用堿性磷酸酶1∶1 000 在10 min 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，記錄不同增強(qiáng)劑和CSPD 濃度的發(fā)光值，分別做出CSPD 濃度－RLU 的曲線和SapphireIIRLU 的曲線(圖1、2)。分析上述數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論:CSPD 在0.4 mmol/L 以下時(shí)，RLU 隨CSPD 濃度的變化而成比例變化，在0.4 mmol/L 時(shí)達(dá)到平臺(tái)，可能是底物濃度在0.4 mmol/L 時(shí)使酶達(dá)到飽和。增強(qiáng)劑SapphireII 濃度對(duì)RLU 的變化，在1.5 g/L 時(shí)達(dá)到最大RLU，隨著增強(qiáng)劑濃度的增加RLU 達(dá)到平臺(tái)期，確定底物工作液配制的濃度為:0.4 mmol/L 的CSPD，增強(qiáng)劑SapphireII 濃度為1.5 g/L。

圖1 不同濃度的增強(qiáng)劑SapphireII 的RLU 的曲線

圖2 不同濃度的底物CSPD 的RLU 的曲線

2.2 包被抗體濃度和酶標(biāo)記抗體濃度的確定 根據(jù)不同包被抗體濃度測(cè)定定量標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值，分別做出不同濃度包被抗體－RLU 的曲線(圖3)。包被濃度低時(shí)試劑的整體發(fā)光值也低，隨著包被濃度的升高發(fā)光值也相應(yīng)升高，在10 μg/mL 時(shí)，發(fā)光值達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期(此時(shí)靈敏度達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期)，選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線接近于直線時(shí)的包被濃度(10 μg/mL)為最佳。

圖3 不同包被濃度對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品RLU 的變化曲線

2.3 最低檢出量 平行測(cè)定20 孔零值校準(zhǔn)品血清，計(jì)算零值校準(zhǔn)品RLU 平均值(x)及標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以+2s 為測(cè)定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對(duì)應(yīng)的濃度值，所對(duì)應(yīng)的濃度值即為最低檢出量為0.5 ng/mL。

2.4 特異性檢測(cè) 分別測(cè)定與AFP(3 μg/mL)、鐵蛋白(10 μg/mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙種球蛋白(200 g/L)的交叉反應(yīng)率，分別為≤0.015%、≤0.034%、≤4.5 ×10－8、≤5.0 ×10－8。

2.5 精密度 測(cè)定CEA 濃度為48.8 ～73.2 ng/mL的質(zhì)控血清，重復(fù)檢測(cè)3 次，每次重復(fù)20 孔，進(jìn)行精密度測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)、批間平均變異系數(shù)分別為8.6%、7.5%。

2.6 正常人血清CEA 醫(yī)學(xué)參考值的確定 對(duì)800份健康人血清檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中有96.1%的健康人血清小于5.0 μg/L，參考值范圍為單側(cè)只有上限而無(wú)下限，按照95% 單側(cè)上限參考值范圍為+1.64s，同時(shí)參考放免檢測(cè)結(jié)果和目前公認(rèn)的正常值范圍，本檢測(cè)方法的正常人血清應(yīng)小于5.0 μg/L。

2.7 準(zhǔn)確度 取3 份臨床樣本分別加入5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 濃度的血清樣品測(cè)試樣品的加入回收率，對(duì)3 份臨床樣本分別進(jìn)行90%、60%、30%稀釋計(jì)算稀釋回收率，結(jié)果顯示:加入平均回收率為97.4%，平均稀釋回收率為101.8%。

2.8 與進(jìn)口試劑的比較 與Bayer ACS:180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的CEA 試劑共同對(duì)100 份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，二者所得的數(shù)值進(jìn)行分析，其相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)，LumiassayTM=0.95 ×ACS:180+0.7789(n=100)，(r=0.968，P ＜0.001)。

圖4 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑

3 討論

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用在臨床檢測(cè)和藥物分析［5］。根據(jù)發(fā)光體系應(yīng)用于免疫分析中的方式不同［6］，可分為:直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫技術(shù)、酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析3 種。本研究采用酶催化法，以酶標(biāo)記抗體或抗原等生物活性物質(zhì)，酶的底物是發(fā)光劑，免疫反應(yīng)復(fù)合物的酶作用于底物，產(chǎn)生光信號(hào)，測(cè)定發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度。癌胚抗原(CEA)為最常用的腫瘤標(biāo)志物之一，其定量檢測(cè)的方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、時(shí)間分辨熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫法，各具特點(diǎn)。

本研究建立的癌胚抗原(CEA)化學(xué)發(fā)光免疫定量分析方法，采用自行設(shè)計(jì)CEA 多抗血清制備和純化工藝，采用改良過碘酸鈉－乙二醇法對(duì)CEA 多抗進(jìn)行ALP 標(biāo)記，較傳統(tǒng)的戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記效率要高，靈敏度、特異性都較好;采用金剛烷衍生物及其增強(qiáng)劑作為發(fā)光底物系統(tǒng)［7］，其酶解速度快，達(dá)到最大光信號(hào)時(shí)間短，且發(fā)光信號(hào)強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，信噪比高，通過優(yōu)化增強(qiáng)劑的濃度能使發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)102～105倍;可測(cè)定濃度線性范圍寬，樣品無(wú)需稀釋即可檢測(cè)。由于化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，從而避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響，有很高的靈敏度，該方法最低檢出量為0.5 ng/mL。與Zhuang［7］等合成一種新型雙吖啶化合物DMDSBA 用于標(biāo)記抗－CEA 抗體建立了一種新的夾心化學(xué)發(fā)光免疫方法，測(cè)定人血清中CEA 的線性范圍為1.0 ～100 ng/mL、檢測(cè)限為0.53 ng/mL 是一致的。該方法克服了傳統(tǒng)的放射免疫法帶來(lái)的環(huán)境污染和健康危害，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)自動(dòng)化程度高，其敏感性、特異性、線性范圍、精密度、回收率均能滿足常規(guī)臨床檢測(cè)要求，并采用開放式反應(yīng)系統(tǒng)，因此可與大多數(shù)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器配套使用，適宜在臨床推廣應(yīng)用。

［1］賀艷峰，張家明，郭小英，等. 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物［J］.化學(xué)通報(bào)，2005，68:135－146.

［2］馮艷銘，馬俊芬，吳飚，等.甲胎蛋白化學(xué)發(fā)光免疫定量分析方法的建立［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(14):1291－1293.

［3］Lin J，Yan F，Hu X，et al.Chemiluminescent immunosensor for CA19－9 based on antigen immobilization on a cross-linked chitosan membrane［J］.Immunol Method，2004，291(1－2):165－174.

［4］Chen D，Kaplan LA.Performance of a new-generation chemiluminescent assay for hepatitis B surface antigen［J］.Clin Chem，2006，52:1592－1598.

［5］尹東光，賀佑豐，劉一兵，等.幾種主要化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光性能及其化學(xué)發(fā)光免疫分析體系［J］. 標(biāo)記免疫分析與臨床，2002，9(4):225－229.

［6］Jie hua LIN，Wei QU，Shusheng ZHANG. Electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on antigen immobilization in gold nanoparticles modified chitosan membrane［J］.Anal Sci，2007，23(9):1059－1063.

［7］Hui-sheng Zhuang，Jin-ling Huang，Guonan Chen. Synthesis of a new biacridine and its using as the chemiluminescent probe for immunoassay of carcinoembryonic antigen［J］. Anal Chim Acta，2004，512(2):347－353.