姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中活性氧水平和caspase-3活性的變化

張 靜 連超群 陳傳好 胡明潔 吳守偉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系遺傳教研室，安徽 蚌埠 233030)

傳統(tǒng)的肺癌化療常因嚴(yán)重?fù)p害人體正常組織細(xì)胞而使臨床應(yīng)用受到限制，尋找毒性低、副作用小的治療藥物成為近年來腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。姜黃素(Curcumin)是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥姜科植物姜黃的根莖中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化和降血脂等多種藥理作用〔1，2〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可能是一種有開發(fā)前景的天然抗癌新藥，其在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，而對(duì)正常組織細(xì)胞幾乎無毒性〔3，4〕。本研究以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，通過檢測(cè)姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的變化，探索姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，RPMI 1640購自 Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33258購自Sigma公司。姜黃素購于美國(guó)Sigma公司，以少量DMSO溶解姜黃素粉劑，配成10 mmol/L貯存液，－20℃保存，臨用時(shí)以完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司，ROS探針2，7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(2，7-dichlo-ro fluorescein diacetate，DCFH-DA)購自Molecular Probes公司，余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞株用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，用0.25%胰酶消化傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，按每孔2 000個(gè)接種于96孔板，每孔100μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以姜黃素終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L 處理細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行孔，并同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照，分別于作用12、24、36、48 h后每孔加入50 mg/L MTT溶液20μl，37℃孵育4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸去上清，每孔加入150μl DMSO，振蕩器震蕩10 min，完全溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量各孔吸光度(A)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組平均A570值－給藥組平均A570值)/對(duì)照組平均A570值×100。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以3×105個(gè)/ml接種于35 mm Petri培養(yǎng)皿底中間的圓形凹槽里，待24 h貼壁后，分組進(jìn)行藥物處理，分對(duì)照組和姜黃素實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組只加培養(yǎng)液和細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入5、10、20、40、80μmol/L的姜黃素。作用 48 h后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛4℃固定10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加10μg/ml的Hoechst 33258染色液于避光染色15 min，PBS漂洗。利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)分析，激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，吸收波長(zhǎng)為(450±15)nm。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 細(xì)胞處理方式以及給藥方法同1.2.3項(xiàng)，藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2～3次后，加入DCFH-DA液，使終濃度為10μmol/L，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光培育20 min，吸除染液，用PBS洗滌3次，利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，分析ROS水平，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)為(590±50)nm。

1.2.5 caspase-3活力檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以3×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，分組進(jìn)行藥物處理，藥物處理同 1.2.3項(xiàng)，藥物作用 48 h后，收集細(xì)胞，按照100μl/200萬個(gè)細(xì)胞的比例加入裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，1 2000 r/min離心15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中，置于冰上;按試劑盒說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在405 nm測(cè)定caspase-3的酶活性，OD405即為樣品中caspase-3催化產(chǎn)生的pNA(p-nitroaniline)產(chǎn)生的吸光度，其值大小反映caspase-3活性強(qiáng)弱。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示。各組間采用單因素方差分析對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用 姜黃素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。在同一濃度作用下，姜黃素實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。在同一處理時(shí)間，隨著姜黃素濃度的增加，除了5μmol/L的姜黃素作用12 h外，其余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較細(xì)胞抑制率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。5～80μmol/L的姜黃素對(duì)A549細(xì)胞作用48 h時(shí)抑制效果最佳，最大抑制率達(dá)80.60%。見表1。

2.2 姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 Hoechst 33258熒光染色照片顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞核膜完整，核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞核為藍(lán)色均勻淡染。不同濃度姜黃素作用A549細(xì)胞48 h后，部分細(xì)胞出現(xiàn)核體積變小，核固縮，細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂，呈現(xiàn)致密的藍(lán)色顆粒狀熒光，表現(xiàn)為典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表明姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。見圖1。

2.3 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞ROS的影響 以熒光強(qiáng)度反映ROS水平。陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度較微弱，ROS最低，姜黃素處理A549細(xì)胞48 h后胞內(nèi)ROS濃度增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，并且ROS隨姜黃素劑量的增加而升高，呈一定的劑量依賴關(guān)系。見表2。

2.4 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞caspase-3活性的影響 以O(shè)D405反映caspase-3活性強(qiáng)弱。經(jīng)不同濃度姜黃素作用48 h后的A549細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性均較陰性對(duì)照組增強(qiáng)，與陰性對(duì)照組相比，除5μmol/L姜黃素實(shí)驗(yàn)組外，其余各濃度實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

圖1 Hoechst33258熒光染色姜黃素對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響(×400)

表1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞抑制率的影響(x ±s，n=3，%)

表2 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞ROS及caspase-3影響(x ± s，n=3)

3 討論

細(xì)胞凋亡作為一種基本的生命現(xiàn)象，在維持機(jī)體自身穩(wěn)定中起重要作用，不僅在正常的組織中存在，在腫瘤組織中亦廣泛存在。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及產(chǎn)生耐藥與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系〔5〕。使用能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制其生長(zhǎng)的抗癌藥物是目前腫瘤治療的主要手段之一。姜黃素是從姜黃、郁金、莪術(shù)、菖蒲等傳統(tǒng)中藥根莖中提取的一種植物多酚，可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡、抑制轉(zhuǎn)移和提高腫瘤細(xì)胞化療敏感性。由于其明顯的廣譜抗腫瘤活性，美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥〔6〕。本研究顯示，姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞A549增殖有明顯的抑制作用，并且表現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間雙重依賴性(P＜0.05)。A549細(xì)胞在姜黃素的作用下出現(xiàn)胞體變小、核固縮、破碎等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。

研究表明氧化應(yīng)激參與了細(xì)胞凋亡的過程，并起了關(guān)鍵作用。ROS是細(xì)胞有氧呼吸過程中產(chǎn)生的O2代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)的統(tǒng)稱，包括所有的含氧自由基和過氧化物。ROS在凋亡中的作用日益受到重視，很多證據(jù)提示在促凋亡信號(hào)作用下ROS的升高可能作為第二信使上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，激活天冬氨酸特異的caspase，參與Ca2+途徑等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)ROS的水平可能通過影響caspase的活性和三磷酸腺苷水平?jīng)Q定細(xì)胞對(duì)促凋亡信號(hào)的效應(yīng)，或凋亡或壞死，或耐受。很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA片段化并誘導(dǎo)凋亡均與引發(fā)ROS改變相關(guān)〔7，8〕。研究表明姜黃素具有調(diào)節(jié)ROS的作用，Bhaumik等〔9〕發(fā)現(xiàn)姜黃素能促使BC-8〔激酶基因內(nèi)含子5(AK-5的單細(xì)胞克隆)〕細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致早老蛋白(PS)殘基外顯，促進(jìn)自由基的釋放，且有助于細(xì)胞外的ROS進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮活性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光染料 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，DCFH-DA可自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在ROS存在下被氧化成DCF，DCF在一定波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光，綠色熒光強(qiáng)度的高低與ROS濃度成正比。研究結(jié)果顯示人肺腺癌A549細(xì)胞在不同濃度姜黃素的作用下，其細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著升高，表明姜黃素的作用可促使細(xì)胞ROS水平顯著升高，且隨姜黃素劑量的增加而升高。說明氧化應(yīng)激參與姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程，ROS的增多可激活多種凋亡途徑，尤其在線粒體凋亡途徑中扮演重要的角色，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

caspase是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一組蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。caspase一經(jīng)激活，將產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-3是caspase家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，被激活后裂解產(chǎn)生17 kD的活性亞單位發(fā)揮作用，參與caspase的兩條不同激活途徑(死亡受體-caspase-8和細(xì)胞色素C-caspase-9酶原激活途徑)。研究表明姜黃素的抗腫瘤作用可能與caspase的激活有關(guān)，孫陽〔10〕研究發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(SHG-44)的增殖，誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡，caspase-3活性增強(qiáng)，各種caspase抑制劑可抑制姜黃素誘導(dǎo)的SHG-44細(xì)胞凋亡。Khar等〔11〕報(bào)道，姜黃素誘導(dǎo)AK-5細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3活性明顯增高，且通過caspase-3抑制劑(DEVD)的抗凋亡作用及Western印跡得到證實(shí)，表明caspase-3參與姜黃素的誘導(dǎo)凋亡過程。本研究結(jié)果顯示姜黃素各濃度實(shí)驗(yàn)組的caspase-3活性均明顯升高，并具有濃度依賴性。表明姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中存在caspase-3的活化，提示姜黃素可能通過激活 caspase-3誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

綜上所述，姜黃素可能通過ROS水平的升高激活caspase-3從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。然而凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，姜黃素究竟通過那條信號(hào)途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡仍有待深入研究。

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