ROS在齊墩果酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡中的作用

楊 玉 劉 莉 商 宇 張鵬霞

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)具有誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用〔1，2〕，但是其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不完全清楚?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團(tuán)，具有強(qiáng)氧化能力〔3〕。本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)及蛋白印跡技術(shù)，檢測 OA處理后 HL-60細(xì)胞caspase-9及ROS的表達(dá)水平，探討OA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為應(yīng)用OA治療白血病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 人早幼粒系白血病HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫?？筩aspase-9抗體購自美國Oncogene公司，抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體為美國Santa cruz公司產(chǎn)品。二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)購于美國Molecular Probe公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 OA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，用含新生牛血清的RPMI 1640稀釋，配制成最終濃度800μmol/L的儲存液。常規(guī)方法配制蛋白質(zhì)免疫印跡試劑。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HL-60細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入含有胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。實驗設(shè)空白對照組與OA用藥組?？瞻讓φ战M:HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含0.05%DMSO的PRMI 1640培養(yǎng)基。OA用藥組:80μmol/L OA處理HL-60 細(xì)胞12 h、24 h和48 h。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)觀察 HL-60細(xì)胞中 ROS的變化〔4〕DCFH-DA以DMSO溶解，磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至終濃度為50μmol/L，避光－20℃保存。實驗開始前24 h，接種細(xì)胞(空白對照組與用藥組)于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度達(dá)每孔5×105個。OA處理細(xì)胞12 h、24 h和48 h。PBS洗2次，離心收集細(xì)胞，加入DCFH-DA液，37℃孵育30 min后，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白的提取及caspase-9測定 分別收集對照組和OA用藥組細(xì)胞。冷PBS洗滌，PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至EP管，加入細(xì)胞裂解液，冰浴，離心，取上清，蛋白濃度經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法測定。煮沸使蛋白變性，等量蛋白(50μg)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離(β-actin，caspase-9:15%)。轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜(NC膜)，封閉后加適量滴度一抗 (β-actin，1∶500;caspase-9，1∶500)，4℃輕搖過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)漂洗，Western Blotting Luminol Reagent化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 OA對HL-60細(xì)胞caspase-9蛋白表達(dá)的影響 42 kD分子量的β-actin蛋白為上樣量對照。不同時間的OA作用于HL-60細(xì)胞后，46 kD分子量的前caspase-9隨時間的增加而減少，這意味著降解后有活性的caspase-9在逐漸增加。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測OA處理HL-60細(xì)胞后ROS水平 以用藥組與對照組的DCFH熒光強(qiáng)度百分比來表示 ROS的水平。結(jié)果顯示，80μmol/L OA能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生ROS，且隨時間的延長而逐漸增加，在48 h ROS達(dá)到最高值。見圖2～圖4。

圖1 各組HL-60細(xì)胞caspase-9蛋白的表達(dá)

圖2 OA處理HL-60細(xì)胞12 h ROS的流式細(xì)胞術(shù)分析

圖3 OA處理HL-60細(xì)胞24 h ROS的流式細(xì)胞術(shù)分析

圖4 OA處理HL-60細(xì)胞48 h ROS的流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討論

在深入研究細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制與信號通路的過程中，以線粒體為核心的凋亡信號通路日益得到人們重視。線粒體及相關(guān)凋亡因子可以作為新型藥物的潛在作用靶點，為疾病(尤其是腫瘤)的治療提供新的策略〔5〕。線粒體凋亡信號通路被活化的關(guān)鍵事件是caspase-9的活化，caspase-9激活下游caspase-3，從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起靶細(xì)胞凋亡。線粒體膜通透性改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)的開放，而 MPTP 的開放與細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，如ROS的堆積密切相關(guān)。ROS是真核細(xì)胞有氧呼吸時的產(chǎn)物，在線粒體電子鏈傳遞過程中，小部分氧不能被完全還原，生成了 ，并可進(jìn)一步演化成H2O2、OH-。這些產(chǎn)物具有較強(qiáng)的氧化能力，統(tǒng)稱為ROS〔6〕。凋亡刺激因子使ROS水平輕度升高可能作為活化信號觸發(fā)線粒體凋亡信號通路，當(dāng)?shù)蛲鰡雍?，ROS進(jìn)一步升高可能起加速凋亡的作用。

為了研究ROS在OA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡中的作用，本研究利用熒光探針DCFH-DA和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS總體水平，此方法是實時觀察測定細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生變化的理想方法〔7〕，觀察到OA作用HL-60細(xì)胞12 h后ROS水平急劇上升，說明HL-60細(xì)胞在OA的作用下，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)被打破。HL-60細(xì)胞ROS水平在0～48 h內(nèi)逐漸升高，在48 h達(dá)到最高峰，說明ROS水平與藥物作用時間有關(guān)。實驗過程中，還觀察到caspase-9隨著OA的作用時間延長而增加，提示OA對HL-60細(xì)胞線粒體凋亡信號通路具有干預(yù)作用。

綜合分析實驗結(jié)果，認(rèn)為OA可以通過影響HL-60細(xì)胞ROS水平，改變線粒體膜通透性，介導(dǎo)促凋亡因子的釋放，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜，各個凋亡通路也并非獨立運轉(zhuǎn)而是彼此交錯、重疊，互相調(diào)控。除ROS外，bcl-2基因家族的某些成員也可以通過影響線粒體膜通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8，9〕?？梢源_定的是OA可以通過改變ROS水平，引起線粒體膜通透性的改變。但是，ROS通路是獨立發(fā)揮作用，還是與其他促凋亡成員相互協(xié)同發(fā)揮作用?如果OA是通過多個因素引起線粒體膜通透性改變，那么ROS通路的作用有多大?這些都有待于進(jìn)一步的研究。

1 Zhang P，Li H，Chen D，et al.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activation and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2007;39(10):803-9.

2 張鵬霞，李鴻梅，陳 東，等.齊墩果酸誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯〔J〕.中國病理生理學(xué)雜志，2008;24(10):1909-11.

3 Jin L，Lenz LL，Cambier JC.Cellular reactive oxygen species inhibit MPYSinduction of IFNβ〔J〕.PLoSONE，2010;5(12):15142.

4 Avlasevich S，Bryce S，De Boeck M，et al.Flow cytometric analysis of micronuclei in mammalian cell cultures:past，present and future〔J〕.Mutagenesis，2011;26(1):147-52.

5 Bouchier-Hayes L，Lartigue L，Newmeyer DD.Mitochondria:pharmacological manipulation of cell death〔J〕.J Clin Invest，2005;115(10):2640-7.

6 Szibor M，Richter C，Ghafourifar P，et al.Redox control of mitochondrial functions〔J〕.Antioxid Redox Signal，2001;3(3):515-23.

7 Wan XS，Zhou Z，Kennedy AR.Adaptation of the dichlorofluorescein assay for detection of radiation-induced oxidative stress in cultured cells〔J〕.Radiat Res，2003;160(6):622-30.

8 Bacsi A，Chodaczek G，Hazra TK，et al.Increased ROS generation in subsets of OGG1 knockout fibroblast cells〔J〕.Mech Ageing Dev，2007;128(11):637-49.

9 張鵬霞，薛芳喜，王迪迪.齊墩果酸對K562細(xì)胞bax、bcl-xL mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(21):2751-2.