電化學(xué)可控制備溶膠-凝膠薄膜在生物傳感器中的應(yīng)用

孫海宜， 崔培英， 尤進茂， 渠鳳麗，2*

（1.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省生命有機分析重點實驗室，山東曲阜273165）

（2.青島科技大學(xué)，橡塑材料與工程教育部重點實驗室，山東青島266045）

0 引言

生物傳感器是生物識別單元與信號轉(zhuǎn)換元件耦聯(lián)形成的功能器件，以生物活性單元作為生物敏感膜，通過各種信號轉(zhuǎn)換器捕捉待測物與敏感物質(zhì)間的反應(yīng)，是分析體系生物化學(xué)信息獲取的重要工具。目前，生物傳感器研究領(lǐng)域需要解決的主要問題是如何提高界面可控性及重現(xiàn)性。傳統(tǒng)傳感界面構(gòu)建的不可控性使得生物傳感器的實用性（重現(xiàn)性）及分析性能（靈敏度、選擇性）均受到影響。要得到靈敏度高、精確度高、成本低、高通量的生物傳感器，性能優(yōu)良的傳感界面構(gòu)建是關(guān)鍵。因此，構(gòu)建化學(xué)可控、生物兼容性好、有利于界面?zhèn)髻|(zhì)與信號轉(zhuǎn)換的生物傳感界面是生物傳感研究領(lǐng)域的熱點問題和一大挑戰(zhàn)。

溶膠-凝膠技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因為其不僅具有好的生物兼容性和化學(xué)惰性、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)，而且硅和有機硅薄膜在室溫下即可在電極表面制備[1～4]。這種薄膜通?？梢酝ㄟ^浸涂(dip-coating)或旋涂(spin-coating)含有適當(dāng)有機硅單體，蒸發(fā)誘導(dǎo)在基底表面水解聚合[5～6]。這種方法操作簡單，但也存在膜厚度不可控制、凝膠膜易脆裂、與金屬電極基底結(jié)合不牢固等缺點，而且此種方法僅限于在平坦基底表面成膜。

溶膠-凝膠過程包含兩步：前驅(qū)物單體在一定條件下水解和水解單體共聚為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)氧化物凝膠。Walcarius小組通過用電化學(xué)沉積方法分步控制溶膠-凝膠過程發(fā)展了溶膠-凝膠制備新方法[7～8]。即在電極/溶液表面施加一個負電位，產(chǎn)生OH-使（僅僅使）電極/溶液表面pH升高從而加快共聚過程生成硅溶膠-凝膠薄膜。此硅溶膠-凝膠膜只會沿著導(dǎo)電基底形成，這樣不僅實現(xiàn)了溶膠-凝膠膜的電化學(xué)可控制備而且實現(xiàn)了在不平基底上的制備。電化學(xué)可控制備方法制備表面介孔溶膠-凝膠膜可改善生物識別特性與信號轉(zhuǎn)換功能，實現(xiàn)固定化與功能化的統(tǒng)一。在溶膠-凝膠合成體系中引入一些小分子有機添加劑可以合成出具有均一介孔特征的材料，促進了界面?zhèn)髻|(zhì)，有利于較大分子的固定化。該文綜述了近年來溶膠-凝膠技術(shù)在生物活性物質(zhì)固定化方面的應(yīng)用和進展，對比了不同溶膠-凝膠技術(shù)在生物傳感器應(yīng)用方面的優(yōu)缺點。

1 浸涂(dip-coating)或旋涂(spin-coating）成膜法

溶膠-凝膠技術(shù)是指有機或無機化合物經(jīng)過溶液、溶膠、凝膠而固化,再經(jīng)過熱處理而制得氧化物或其它化合物固體的方法，包括水解和聚合、凝膠化、老化和干燥等幾個步驟。溶膠-凝膠薄膜通?？梢酝ㄟ^浸涂 (dip-coating)或旋涂(spin-coating)含有適當(dāng)有機硅單體，蒸發(fā)誘導(dǎo)在基底表面水解聚合。溶膠-凝膠技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用早期大都是通過此種成膜方法。與其它固化方法相比,溶膠-凝膠包埋法可以較好地保持蛋白質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)的整體性和方向均一性,所以對組份的活性和穩(wěn)定性的損傷較小。因而可較好地保持生物活性，適用于任何種類生物組份，并且具有高的熱穩(wěn)定性和光化學(xué)穩(wěn)定性[9～11]。Braun和他的同事們[12]成功地將堿性磷酸酯酶埋入TMOS的Sol-gel中,所得的復(fù)合生物活性材料在室溫的水溶液中放置了2個月而沒有失活。Barrero[13]用硅凝膠固定的pyoverdin熒光法分析了Fe3+,實驗中沒有發(fā)現(xiàn)試劑的泄漏,且其穩(wěn)定性在溶膠－凝膠基底中得到了增強。Tastsu[14]制備了含有葡萄糖酶(GOD)的TEOS溶膠－凝膠,他們研究了包埋GOD的回收率、酶活性與老化時間的關(guān)系，溶液中酶的活性在4℃保存了2個月后仍然存在,并隨老化溫度的升高而降低。Wang[15～17]亦分別研究了溶膠－凝膠碳復(fù)合的葡萄糖傳感器和IgG免疫傳感器。

2 電化學(xué)方法引導(dǎo)超薄溶膠-凝膠膜

溶膠-凝膠過程包含兩步：前驅(qū)物單體在一定條件下水解(方程式 1，酸性條件，pH=3)，水解單體共聚為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的氧化物凝膠(方程式2，堿性條件，pH=8)。

Walcarius小組通過用電化學(xué)沉積方法分步控制溶膠-凝膠過程發(fā)展了溶膠-凝膠制備新方法。即在電極/溶液表面施加一個負電位，產(chǎn)生OH-使（僅僅使）電極/溶液表面pH升高從而加快共聚過程生成硅溶膠-凝膠薄膜[18～21]。電化學(xué)方法分步沉積溶膠－凝膠膜有兩個明顯不同過程。第一階段為本體溶膠-凝膠化過程，第二階段為界面溶膠-凝膠化過程。構(gòu)建電化學(xué)可控生物傳感界面，控制溶膠-凝膠膜只在基底上形成是關(guān)鍵問題。這就要求用電化學(xué)方法在基底表面電沉積溶膠-凝膠薄膜時，一是要減緩本體溶膠-凝膠化過程，二是控制界面溶膠-凝膠化過程。溶膠濃度、溶膠組份、水解時間、水解溫度及體系是否攪拌等是決定本體溶膠-凝膠化的主要影響因素[22～23]。減緩本體溶膠－凝膠化過程，盡量減少溶膠-凝膠化過程在溶液中進行，從而保證溶膠-凝膠化過程僅在導(dǎo)電基底表面進行。

控制膜厚度是發(fā)展溶膠-凝膠電化學(xué)可控技術(shù)的關(guān)鍵部分之一，因為膜厚度不僅影響界面?zhèn)髻|(zhì)也影響信號轉(zhuǎn)化能力，更會直接影響響應(yīng)信號的靈敏度[24]。電化學(xué)過程的有效速率常數(shù)（Keff）和擴散控制電流（Ilim）成正比關(guān)系，和膜厚度（d）成反比關(guān)系，具體可用下列關(guān)系式（3）表達:

其中，n是電化學(xué)過程中轉(zhuǎn)移電子數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)(C mol-1)，A為電極面積 (cm2)，c是溶液中氧化還原探針濃度 (mol.cm-3)，P是溶液和膜之間的分配系數(shù)，Df是透過膜的表觀擴散常數(shù)(cm2.s-1)，d為膜厚度(cm)?？刂瞥练e速度是控制膜厚度的關(guān)鍵，也是發(fā)展溶膠-凝膠膜電化學(xué)可控制備方法的關(guān)鍵。

Walcariu小組用此電化學(xué)方法通過使用非常稀的正硅酸乙酯單體、調(diào)節(jié)沉積時間和沉積電壓成功制備了生物兼容性好的硅溶膠-凝膠超薄膜（＜100 nm）（圖1）[25]并用于血紅蛋白固定。 多孔電極大的比表面積使得它相對傳統(tǒng)電極有更高靈敏度。Walcarius小組與Kuhn小組合作，通過模板法制備多孔金電極[26～27]，并用電化學(xué)方法在多孔金電極內(nèi)壁上沉積硅溶膠-凝膠薄膜。沉積完成后沒有堵塞微孔以及微孔之間的通道，保證了界面?zhèn)髻|(zhì)的有效性（圖2）[25]。電化學(xué)方法調(diào)節(jié)pH的方法只允許催化縮聚在電極/溶液界面進行，這就有利于均勻地在多孔金電極內(nèi)壁沉積硅薄層而不會堵塞內(nèi)孔。此方法擴大了溶膠-凝膠膜在各個領(lǐng)域的應(yīng)用前景，在不平基底上實現(xiàn)了生物分子的無損固定化。

圖1 在平坦金電極基底上電化學(xué)沉積TEOS溶膠-凝膠膜后的AFM(A)、AFM-3D(B)圖Fig.1 AFM image of a flat substrate after electrochemical deposition of TEOS sol-gel film,(A),AFM-3D(B)

圖2 在13.6 mmol/L TEOS溶膠中浸15 min后,再電沉積20 s超薄硅膜的多孔金電極（9/2層）的高分辨圖(B-D)Fig.2 High resolution views(B-D)of a slice(A)of a macroporous gold electrode(9/2 layers)decorated with an ultra-thin silica film electrogenerated for 20 s,after 15 min wetting in a sol made of 13.6 mmol/L TEOS

3 電化學(xué)方法引導(dǎo)超薄介孔溶膠-凝膠膜

表面?zhèn)髻|(zhì)是影響生物傳感器性能的重要因素之一，介孔膜的構(gòu)建有利于提高生物傳感器的表面?zhèn)髻|(zhì)。1998年,Wei等[28～29]首次成功的以非表面活性劑(主要是有機小分子,如D-葡萄糖、聯(lián)苯甲酰-L-酒石酸、D-麥芽糖等)為模板,經(jīng)溶膠-凝膠法制備出具有大比表面積和高孔容的介孔SiO2材料。該方法具有操作簡單、成本低、反應(yīng)條件溫和等特點,并且材料的孔徑大小可以通過控制有機小分子模板的濃度進行調(diào)節(jié),可用于較大生物分子的固定化[30]。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)在溶膠-凝膠合成體系中引入一些小分子有機添加劑可以合成出具有均一介孔特征的材料。尤其是模板法合成介孔材料具有操作簡單、可控性強等優(yōu)點，已經(jīng)顯示出良好的發(fā)展前景。Takahashi等[31]將檸檬酸作為有機小分子添加劑引入到SiO2合成體系中制備出高比表面、孔徑均一分布的介孔SiO2材料。通過調(diào)節(jié)檸檬酸的用量,材料的孔徑大小在2～12 nm范圍內(nèi)可調(diào)。檸檬酸在合成過程中起到模板劑的作用，有利于介孔的形成。Zheng等[32]以尿素和環(huán)糊精有機分子作為模板劑,在室溫下通過鈦酸丁酯醇溶液的水解縮聚反應(yīng)制出介孔TiO2材料。

正如Brinker和Dunphy討論的那樣，以表面活性劑為模板制備介孔材料要解決的兩個重要問題就是控制孔道方向和形貌[33～34]。介孔孔道的尺寸及方向制約材料的性能，影響分子的有效擴散。實驗證明介孔孔道方向垂直于基底的介孔材料有利于分子無障礙通過。近期雖有報道通過化學(xué)修飾固-液界面和（或）維度限制自組裝過程來控制成核和孔道方向，而所有納米結(jié)構(gòu)孔道均垂直于基底仍然有挑戰(zhàn)。Walcarius小組提出用電化學(xué)方法引導(dǎo)，以表面活性劑為模板在各種不同基底上自組裝垂直于基底的均一多孔硅薄膜[24,35～38]。孔的方向控制主要是如何通過電化學(xué)方法誘導(dǎo)模板在導(dǎo)電基底的有序組裝 （圖3）[35]。影響模板有序組裝的各種因素主要有電荷密度、模板間的定向作用力等。通過電化學(xué)方法實現(xiàn)模板在基底上的有序組裝，從而實現(xiàn)孔道方向垂直于基底表面介孔膜的制備[8,39～40]。該方法結(jié)合了電化學(xué)引導(dǎo)表面活性劑在固-液表面自組裝及電化學(xué)方法制備溶膠-凝膠超薄膜原理。即對含有模板的電極/溶膠表面應(yīng)用一個合適的陰極電位產(chǎn)生催化縮聚所必需的OH-并自組裝垂直于電極的一維通道。Walcarius小組研究了不同導(dǎo)電基底、模板與溶膠比例等對成孔尺寸的影響。該方法是兼容控制的在異構(gòu)基底上的局部沉積，開辟了電化學(xué)方法制備復(fù)雜模式介孔材料的道路。

圖3 初步制備的介孔溶膠－凝膠納米薄膜的掃描電鏡圖Fig.3 TEM images of the electrodeposited sol-gel nanometer thin films with mesoporous

4 展望

在電化學(xué)可控方法制備介孔溶膠-凝膠薄膜的研究基礎(chǔ)上，電化學(xué)方法制備表面介孔溶膠-凝膠納米材料復(fù)合膜將會在提高傳感器的靈敏度方面有一定潛力?？梢赃M行溶膠-凝膠有機高分子復(fù)合膜生物兼容性、電化學(xué)特性及其在生物傳感界面構(gòu)建中的應(yīng)用研究。因為聚合膜可以進一步提高體系的生物相容性，提高生物分子的修飾能力，也可以作為媒介體改善信號轉(zhuǎn)換能力?？梢蚤_展原位電化學(xué)方法共沉積摻雜了電化學(xué)活性物質(zhì)（亞甲基藍等）的溶膠-凝膠復(fù)合膜的電化學(xué)性質(zhì)及其在生物傳感界面構(gòu)建中的應(yīng)用研究。因為具有氧化還原活性的電活性物質(zhì)在和硅烷化試劑共聚的時候可以起到交聯(lián)劑的作用，有利于形成更強勁穩(wěn)定的表面控制共聚膜。這個過程包含了對氧化還原薄膜中氧化還原中心的＂稀釋＂作用，保證了較高電子轉(zhuǎn)移效率。近年來，納米材料在電子設(shè)備和納米傳感器等許多領(lǐng)域得到廣泛研究與應(yīng)用。因為納米結(jié)構(gòu)的材料具有獨特的光學(xué)、電學(xué)和催化特性及良好的生物相容性。可以開展原位電化學(xué)方法共沉積摻雜了無機納米材料（碳納米管、金納米顆粒等）、無機半導(dǎo)體納米粒子（ZnS、CdS等）的復(fù)合溶膠-凝膠膜的電化學(xué)催化能力及其在生物傳感界面中的應(yīng)用研究。研究電化學(xué)引導(dǎo)溶膠-凝膠薄膜的新方法，制備過程簡單，成膜厚度可控，又可在不平基底上成膜，必將為今后的生物組份固化技術(shù)、生物傳感器的制備提供更多的機會和條件。

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