妥拉蘇林有序介孔硅表面分子印跡傳感器的研制

龔 偉， 徐 嵐,王亞瓊

(1.西南大學化學化工學院，重慶400715)

(2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，重慶404020)

0 引言

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique,MIT)是將功能單體,在模板分子的存在下交聯(lián)聚合,然后洗脫除去模板分子,得到對模板分子具有特異選擇性的聚合物的過程[1]。分子印跡聚合物(MIP)具有選擇性高、穩(wěn)定性好、抗惡劣環(huán)境能力強等特點[2]。但普通方法制得的印記聚合物結(jié)合位點和印跡空隙嵌入較深，響應時間較長[3]；表面分子印跡聚合可以使印跡定位于表面，但吸附的穩(wěn)定性和吸附能力要低很多[4]。如果選擇在有序介孔硅（SBA）上分子印跡，這些問題似乎可以得到解決。有序介孔硅具有巨大的比表面積和空隙容積[5]，良好的熱穩(wěn)定性[6]，易功能化，窄的孔徑分布以及孔徑大小可調(diào)[7～8]等特點。它能比普通的SiO2提供更多的活化/功能位點。由于有較高的比表面積，可以提高印跡聚合物與模板分子的相互作用，可以提高電化學傳感器的性能。

妥拉蘇林屬嗎啡類藥物，異喹啉類生物堿,是一種非特異性解痙藥,臨床上主要用于血管痙攣性疾病[9]。目前檢測妥拉蘇林的方法主要有光譜法[10]、色譜法[11]以及氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。這些方法具有易受基體干擾、樣品前處理復雜、耗時長以及檢測成本高等缺點。為避免這些缺點，可以先對介孔硅表面進行修飾，見圖1，在介孔硅表面連接氨基，并在氨基基礎(chǔ)上連接酸性基團羧基。 采用分子印跡技術(shù)，使介孔硅表面的酸性基團與堿性的妥拉蘇林分子以離子鍵結(jié)合，然后印跡聚合形成對妥拉蘇林有特異性識別的分子印跡聚合物（SBA-MIP），將SBA-MIP制成碳糊電極。結(jié)果表明，SBA-MIP電極對妥拉蘇林的響應有顯著增強，顯示出良好的選擇性。

圖1 介孔硅修飾原理圖Fig.1 Scheme of modified mesoporous silica

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI660C型電化學工作站 (上海辰華儀器有限公司),三電極體系：研制的傳感器為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極；CL-20型恒溫加熱磁力攪拌器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；3H-2000Ⅲ比表積測試儀 （北京貝士德儀器科技有限公司）；JA2003A電子天平 （上海精天電子儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥儀（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；TENSOR27紅外光譜儀 （德國BRUKER光譜儀器公司）。

妥拉蘇林鹽酸鹽和萘甲唑啉鹽酸鹽(分析純，USA，Across Organics)使用前先用NaOH溶液中和，再用氯仿萃取，除去溶劑，真空干燥備用[12]；P123(分析純，Sigma化學試劑有限公司)；正硅酸乙酯 （TEOS，98%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（98%）和氯乙酸鈉（98%）均購于Alfa Aesar化學試劑有限公司；三乙胺（分析純，成都科龍化工）。其它試劑均為分析純試劑,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 SBA-15的合成[9,13]

將 4 g P123（EO20PO10EO20）溶于 30mL 水，再加入120mL 2 mol/L的HCl溶液，攪拌5 h。然后在攪拌下逐滴加入9.5 g TEOS，劇烈攪拌10 min，40℃保溫靜置24 h，升溫到80℃保溫靜置24 h。抽濾，用水反復清洗得到的固體物質(zhì)，80℃干燥后將固體物質(zhì)在馬弗爐內(nèi)灼燒6 h（550℃），得到SBS-15。

1.2.2 氨基修飾SBA-15[14～15]

1.0 g SBA-15放入100mL圓底燒瓶內(nèi)，加入50mL正己烷和5mL 3-氨基丙基三乙氨基硅烷，在氮氣保護下70℃攪拌回流12 h，再用乙醇清洗，80℃干燥12 h，得到氨基修飾的SBA-15(APSBA)。

1.2.3 羧基修飾SBA-15[16]

AP-SBA-15與30mL乙醇、20mL三乙胺以及氯乙酸鈉混合，80℃保溫反應48 h，產(chǎn)物用水和乙醇反復清洗，80℃真空干燥，得到羧基修飾的SBA-15(IDA-SBA)。

1.2.4 印跡聚合物SBA-MIP的合成

取處理過的妥拉蘇林1.0 g溶于50mL乙醇，加入2.0 g IDA-SBA與之反應2 h。加入5mL的TEOS、4mL 1.0 mol/L的醋酸溶液，在45℃保溫攪拌10 h，過濾[17]。所得的固體用乙醇反復清洗，再用 V（甲醇）∶V（乙酸）=4∶6 的混合溶液在索氏提取器中提取48 h[18]，用乙醇洗滌，直至檢測（氣相色譜）不到妥拉蘇林分子，最后將聚合物SBA-MIP干燥備用。

未印跡聚合物SBA-NIP的合成方法與之相同，只是不加入妥拉蘇林。同法還用于合成SiO2-MIP和SiO2-NIP。

1.2.5 碳糊電極傳感器的制備

將0.02 g的SBA-MIP、0.18 g的石墨和0.05mL液體石蠟放入瑪瑙研缽中研磨均勻,將其壓入直徑為3 mm的碳糊電極內(nèi)，壓實后在紙面上打磨光滑[19]，制得SBA-MIP電極傳感器。相同的方法制得 SBA-NIP、SBA-15、SiO2-MIP 和 SiO2-NIP電極傳感器。

1.3 檢測方法

利用循環(huán)伏安法對妥拉蘇林檢測。檢測電位區(qū)間為-0.2～0.6 V,掃描速度為0.05 V/s。將傳感器在pH6.5的妥拉蘇林溶液中靜態(tài)吸附5 min，在測試底液（0.1 mol/L KCl、5 mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀）中用循環(huán)伏安法測試，根據(jù)傳感器吸附妥拉蘇林后電流量（取氧化峰峰值）的減少值來確定電極對妥拉蘇林的吸附量。每次測試前傳感器需在紙面上打磨光滑。

2 結(jié)果和討論

2.1 紅外表征

為了證明印跡聚合物的聚合過程，采用紅外光譜加以分析，SBA-15，AP-SBA，SBA-MIP 和SBA-NIP的紅外圖見圖2。如圖所示，在800和460 cm-1附近為Si-O峰；1 058和1 080 cm-1附近為Si-O-Si的伸縮振動峰；1 559 cm-1附近為N-H彎曲振動峰，1 747 cm-1附近為C=O峰；2 945 cm-1附近為C-H伸縮振動峰；3 450 cm-1附近為H-O峰。圖中AP-SBA與SBA-15比較多了1 559 cm-1的N-H峰和2 945 cm-1的C-H峰，說明聚合物中多了亞甲基和氨基，3 450 cm-1的H-O峰的減小也從側(cè)面證明了聚合物被氨基修飾。SBA-MIP和SBA-NIP的圖譜基本相同，與AP-SBA比較少了1 559 cm-1的N-H峰，卻多了1 747cm-1的C=O峰，說明了羧基對聚合物修飾的成功。

圖2 SBA-15,SBA-MIP和SBA-NIP紅外圖Fig.2 FT-IR spectra of SBA-15,SBA-MIP and SBA-NIP

2.2 比表面積測定

N2吸附曲線和孔徑分布見圖3和表1,結(jié)果表明SBA-MIP的比表面積、空隙容積和空隙大小均比SBA-15小。SBA-MIP的主要孔徑分布在5.499 nm附近，SBA-15在6.252 nm左右，其差別可能是在印跡聚合時改變的。該結(jié)果表明，印跡聚合主要發(fā)生在SBA-15表面包括內(nèi)部空隙表面。同時該結(jié)果也說明對SBA-15的修飾并未改變材料的主要結(jié)構(gòu)。

圖3 SBA-15和SBA-MIP的吸附曲線和孔徑分布圖Fig.3 N2adsorption/desorption isotherms and pore size distributions of SBA-15 and SBA-MIP

表1 SBA-15和MIP-SBA的結(jié)構(gòu)性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of hexagonal SBA-15 and MIP-SBA

2.3 不同傳感器對妥拉蘇林的響應情況

分別制備石墨、SiO2-NIP、SiO2-MIP、SBA-15、SBA-NIP和SBA-MIP傳感器，在pH6.5，濃度為10 μmol/L的妥拉蘇林溶液中靜置5 min后，用循環(huán)伏安法在測試底液測試，測試結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，SBA-MIP對妥拉蘇林的吸附相較于其他傳感器有明顯的優(yōu)勢，說明SBAMIP對妥拉蘇林有特異性吸附。

圖4 不同電極對傳感器響應的影響，a為石墨，b為SiO2-NIP,c為SiO2-MIP,d為SBA-NIP,e為SBA-15,f為SBA-MIP電極Fig.4 Influence of the different electrodes on the response of the sensor.(a)graphite,(b)SiO2-NIP,(c)SiO2-MIP,(d)SBA-NIP,(e)SBA-15 and(f)SBA-MIP sensors

2.4 SBA-MIP傳感器對妥拉蘇林的選擇性

將制備的MIP和NIP電極分別置于不同濃度的妥拉蘇林和結(jié)構(gòu)類似物萘甲唑啉溶液中富集5 min后，用循環(huán)伏安法檢測，結(jié)果如圖5所示。MIP對萘甲唑啉的吸附明顯少于妥拉蘇林，NIP萘甲唑啉和妥拉蘇林的吸附?jīng)]有明顯變化，結(jié)果表明，MIP對妥拉蘇林有很好的選擇性。

圖5 妥拉蘇林a和萘甲唑啉c的印跡電極響應曲線，妥拉蘇林b和萘甲唑啉d的非印跡電極響應曲線Fig.5 Response curves for(a)tolazoline and(c)naphazoline on imprinted electrode,(b)tolazoline and(d)naphazoline on nonimprinted electrode

2.5 傳感器的優(yōu)化

2.5.1 吸附時間對傳感器的影響

將SBA-MIP傳感器放入100 μmol/L妥拉蘇林溶液中，吸附不同時間，在測試底液中用循環(huán)伏安法測定其響應電流的變化，如圖6所示。實驗發(fā)現(xiàn),最初隨著富集時間的增加，妥拉蘇林的峰電流值降低很快，當超過5 min以后，峰電流隨富集時間的增加而趨于平緩，所以實驗中選擇富集的時間為5 min。

圖6 富集時間對傳感器響應的影響Fig.6 Influence of the incubation time on the response of the sensor

2.5.2 溶液酸堿度對傳感器的影響

固定妥拉蘇林濃度為 100 μmol/L,在 4.0～10.0范圍內(nèi)改變測試背景溶液的pH,用循環(huán)伏安法測試電極的響應變化，如圖7所示，當pH值為6.0時,峰電流值達到最小，說明此條件下的識別效果最好。

圖7 在濃度為1.0×10-5mol/L的妥拉蘇林溶液中，pH對MIP和NIP峰電流的影響Fig.7 Influence of pH value on the peak current of 1.0×10-5mol/L

2.6 傳感器的線性范圍和檢出限

在最優(yōu)的條件下，將SBA-MIP傳感器在不同濃度的妥拉蘇林溶液中靜置5 min，再用循環(huán)伏安法測定，取氧化峰峰值，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出,妥拉蘇林的濃度在0.4～5 μmol/L和5～100 μmol/L的范圍內(nèi)與峰電流值呈良好的線性關(guān)系。線性方程分別為ip(μA)=0.587 3 c(μmol/L)-105.738 和 ip(μA)=0.050 0 c(μmol/L)-104.837,相關(guān)系數(shù)分別為 0.971 7 和 0.994 0,檢測限為 1.6×10-8mol/L。

圖8 印跡傳感器對妥拉蘇林的響應校正曲線Fig.8 Calibration curve of imprinted electrode for tolazoline

2.7 實際樣品分析

取10.0mL正常人體尿樣，采用標準加入法向其中加入一定量的妥拉蘇林標準溶液，放入研制的傳感器富集5 min，在底液中用循環(huán)伏安法測定，每個濃度的樣品測定3次，取其平均值（表2）。計算得到其回收率范圍為 97.5%～104.2%，相對標準偏差為0.03%～0.21%,表明傳感器具有一定的潛在實際應用價值。

表2 尿樣中妥拉蘇林含量的測定Tab.2 Result for the determination of tolazoline in urine samples

[1]陳暉,戴紅霞.分子印跡技術(shù)在中藥研究中的應用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(3):138～140.

[2]姜忠義,吳洪.分子印跡技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003:3.

[3]張挪威,丁明星,劉國艷,等.琥珀酸氯霉素分子印跡聚合膜的制備及其吸附特性研究[J].化學學報,2008,66:1 961～1 966.

[4]Joshi V P,Kulkarni M G,Mashelkar R A.Enhancing adsorptive separations by molecularly imprinted polymers:Role of imprinting techniques and system parameters[J].Chem.Eng.Sci.,2000,55:1 509～1 522.

[5]Takahashi S,Ikkai Y,Sakamoto K.Preparation of rectangular and 2D-hexagonal mesostructured silica at neutral conditions using poly(oxyethylene)cholesterylethers and a water-soluble silica precursor[J].J.Colloid.Interface.Sci,2009,335:70～76.

[6]Yu H,Zhai Q-Z.Mesoporous SBA-15 molecular sieve as a carrier for controlled release of nimodipine[J].Microporous and Mesoporous Materials,2009,123:298～305.

[7]Pérez-Quintanilla D,Hierro I del,Fajardo M.Mesoporous silica functionalized with 2-mercaptopyridine:Synthesis,characterization and employment for Hg(Ⅱ)adsorption[J].Micropor.Mesopor.Mater,2006,89:58～68.

[8]Hartmann M,Vinu A,Langmuir.Mechanical Stability and Porosity Analysis of Large-Pore SBA-15 Mesoporous Molecular Sieves by Mercury Porosimetry and Organics Adsorption[J].Langmuir,2002,18:8 010～8 016.

[9]Thomas M,Campbell H,Heard G E.Evaluation of oral thymoxamine in patients with peripheral vascular occlusion of the lower limbs[J].Brit.J.Surg,1973,60:545 ～548.

[10]Elries M A,Khalil S.Indirect atomic absorption determination of atropine,diphenhydramine,tolazoline,and levamisole based on formation of ion-associates with potassium tetraiodometrcurate[J].J.Pharm.Biomed.Anal,2001,25:3～7.

[11]Caufiedld W V,Stewart J T.Rapid determination of selected drugs of abuse in human plasma using a monolithic silica holc column and solid phase extraction[J].J.Liq.Chromatogr.Related Technol,2002,25:2 977～2 988.

[12]Haruyo Sanbe,Jun Haginaka.Restricted access mediamolecularly imprinted polymer for propranolol and its application to direct injection analysis of β-blockers in biological fluids[J].J.Analyst,2003,128:593～597.

[13]Zhao D Y,Feng J L,Huo Q S.Triblock Copolymer Syntheses of Mesoporous Silica with Periodic 50 to 300 Angstrom Pores[J].Science,1998,279:548～552.

[14]Zheng S,Gao L,Guo J.Synthesis and Characterization of Functionalized MCM-41 withCopper`andManganese`Phenanthroline Complexes[J].Solid State Chem,2000,152:447～452.

[15]Wang L,Qi T,Zhong Y.Novel organic-inorganic hybrid mesoporous materials for boron adsorption[J].Colloids and Surfaces A:Physicochem.Eng.Aspects,2006,275:73～78.

[16]Gao Zhifeng,Wang Lina,Qi Tao.Synthesis,characterization,and cadmium(Ⅱ)uptake of iminodiacetic acidmodi fi ed mesoporous SBA-15[J].Colloids and Surfaces A:Physicochem.Eng.Aspects,2007， 304:77～81.

[17]Jiang Xiaoman,Wei Tian,Zhao Chuande.A novel solgel-material prepared by a surface imprinting technique for the selective solid-phase extraction of bisphenol A[J].Talanta,2007,72:119～152.

[18]呂瑞紅,徐嵐.水溶液懸浮聚合法制備妥拉蘇林分子印跡聚合物微球及其性能研究[J].分析測試學報,2008,27(12):1 347～1 350.

[19]Wang Fengran,Yang Jinquan,Wu Kangbing.Mesoporous silica-based electrochemical sensor for sensitive determination of environmental hormone bisphenol A[J].Analytica Chimica Acta,2009,638:23～28.