蒲地藍(lán)消炎顆粒微生物限度檢查及有效性驗(yàn)證試驗(yàn)研究*

田桂英

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

蒲地藍(lán)消炎顆粒為固體口服給藥制劑，功能為清熱解毒，抗炎消腫。臨床上用于治療癤腫、咽炎、扁桃腺炎等。但其對(duì)細(xì)菌有抑菌作用，為了保證微生物限度檢查結(jié)果的真實(shí)可靠，應(yīng)消除其抑菌性，以保證藥品受微生物污染的程度被檢出。本實(shí)驗(yàn)建立了蒲地藍(lán)消炎顆粒微生物限度檢查方法，并根據(jù)《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果符合《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查法的要求。

1 儀器和試藥

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基。菌種：大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(B)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(B)98003]，上述菌種均購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所，由本所傳代，保存，本試驗(yàn)所用菌種均為第3代。新鮮配制的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液。薄膜過(guò)濾裝置：美國(guó)whatman薄膜過(guò)濾器。蒲地藍(lán)消炎顆粒(天津隆順榕制藥廠，批號(hào)070304、 070306 、070308)。

2 方法和結(jié)果

2.1《中國(guó)藥典》方法 鑒于日常工作中已知蒲地藍(lán)消炎片對(duì)細(xì)菌有抑制作用，故先采用常規(guī)法和稀釋法同步進(jìn)行了本品細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)。霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)按常規(guī)法進(jìn)行。

2.1.1菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入4 ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，每制成1 ml含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.1.2細(xì)菌計(jì)數(shù)

2.1.2.1供試品的制備 取本品10 g，加pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，分散均勻，作為1∶10的供試液，常規(guī)法每皿取供試液1 ml，稀釋法取供試液1 ml，等量分注5個(gè)平皿中，每皿0.2 ml。

2.1.2.2試驗(yàn)組 取1∶10的供試液1和0.2 ml分別注入平皿中，再分別加入規(guī)定量的陽(yáng)性對(duì)照菌(約50～100 cfu)，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.2.3菌液組 取規(guī)定量的上述陽(yáng)性對(duì)照菌(約50～100 cfu)，分別注入平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.2.4供試品對(duì)照組 取1∶10的供試液1 和0.2 ml分別注入平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

2.1.3.1試驗(yàn)組 取上述1∶10的供試液1 ml置平皿中，同時(shí)在每皿中加入規(guī)定量的試驗(yàn)菌(約50～100 cfu )，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3.2菌液組 取規(guī)定量的試驗(yàn)菌(約50～100 cfu )于平皿中,傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.3.3供試品組 同試驗(yàn)組供試品處理，不加試驗(yàn)菌。

2.1.4結(jié)果 本品采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組的回收率均低于70%；采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%。表明本品對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法都不能消除其抑菌性，但對(duì)霉菌和酵母菌無(wú)抑制作用，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)可按常規(guī)法進(jìn)行，見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)法和稀釋法試驗(yàn)結(jié)果

2.2離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.2.1試驗(yàn)組 取本品10 g，加pH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，取10 ml置離心管中，先以500 r/min離心3 min，取上清液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入約50～100 cfu的試驗(yàn)菌，取膜貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.2.2菌液組 取規(guī)定量的試驗(yàn)菌(約50～100 cfu)，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

2.2.3供試品對(duì)照組 同試驗(yàn)組供試品處理，不加試驗(yàn)菌。

2.2.4稀釋劑對(duì)照組 取規(guī)定量的試驗(yàn)菌(約50～100 cfu )，同供試品處理后，薄膜過(guò)濾，用200 ml pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗后，取膜貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

2.2.5結(jié)果 大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組的回收率均大于70%，見(jiàn)表2，結(jié)果表明離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法能較好的消除本品對(duì)細(xì)菌的抑制作用。

2.3控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。

2.3.2大腸埃希菌驗(yàn)證方法

2．3.2.1試驗(yàn)組 取上述1∶10的供試液10 ml和規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

2.3.2.2陰性菌對(duì)照組 取1∶10的供試液10 ml和規(guī)定量的金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.2.3陽(yáng)性對(duì)照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.2.4供試品對(duì)照組 取1∶10的供試液10 ml置100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

取試驗(yàn)組、陰性菌對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、供試品對(duì)照組上述培養(yǎng)物各0.2 ml，分別接種于含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，分別于5和24 h在366 nm紫外光下檢視，試驗(yàn)組管MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性；陰性菌對(duì)照組管MUG陰性，靛基質(zhì)陰性；陽(yáng)性菌對(duì)照組管MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性。

2．3.2.5試驗(yàn)結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照組未檢出大腸埃希菌，試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌。驗(yàn)證結(jié)果符合要求。見(jiàn)表3。

表3 大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

2.3.3大腸菌群驗(yàn)證方法

2.3.3.1試驗(yàn)組 取上述1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.2陰性菌對(duì)照組 取1∶10的供試液1 ml和規(guī)定量的金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.3陽(yáng)性對(duì)照組 取規(guī)定量的大腸埃希菌(約50～100 cfu)加入10 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.3.3.4供試品對(duì)照組 取1∶10的供試液10 ml置100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.3.5試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組管和陽(yáng)性對(duì)照組管均有菌生長(zhǎng)且產(chǎn)酸產(chǎn)氣，均檢出大腸菌群。陰性菌對(duì)照組管和供試品對(duì)照組管無(wú)菌生長(zhǎng)，且不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，未檢出大腸菌群。驗(yàn)證結(jié)果符合藥典要求，見(jiàn)表4。

表4 大腸菌群驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

微生物污染的監(jiān)控是藥品安全性評(píng)價(jià)的重要手段，中成藥制劑大多是多種中藥成分經(jīng)煎煮、提取、濃縮而成，其中某一種成分在試驗(yàn)條件下如果有抑菌作用則干擾整個(gè)制劑的微生物檢驗(yàn)結(jié)果。中成藥制劑中通常含有具有一定抑菌作用的藥物,如牛黃、大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、三七等,這些藥物在處方中由于劑量的大小及來(lái)源質(zhì)量的差異,決定了它們?cè)谥苿┲幸志饔玫膹?qiáng)弱。而且具有抑菌作用的中成藥制劑大多是對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用。只有采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ苿┑囊志饔?，使之不影響微生物的檢查結(jié)果，同其他的分析方法一樣，證明所采用的方法是適宜的，才能保證結(jié)果的真實(shí)性、客觀性。

蒲地藍(lán)消炎顆粒的主要成分有黃芩、蒲公英、板藍(lán)根等，細(xì)菌計(jì)數(shù)先分別采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)按常規(guī)法驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%，表明蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)霉菌和酵母菌無(wú)抑制作用，所以霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法可以采用操作簡(jiǎn)單的常規(guī)法進(jìn)行。本文針對(duì)蒲地藍(lán)消炎顆粒對(duì)細(xì)菌的抑制作用，又采用了離心沉淀聯(lián)合薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果上述3種菌的回收率均大于70%，能較好的消除其抑菌作用，說(shuō)明該方法合理、有效、可行。