肽合成*

張 宇,烏 恩,王國成

(1.內蒙古醫(yī)學院藥學院，呼和浩特 010110； 2.天津天士力研究院化學藥物研究所，天津 300402)

上世紀90年代，多肽領域研究進入一個嶄新的發(fā)展階段。研究表明，生物體內含量極微的活性肽在生命過程中起著重要的調控作用[1-3]，這些活性肽與生物的發(fā)育、生長代謝、免疫、疾病、學習、記憶和衰老都有極其密切的關系。與傳統(tǒng)藥物相比，活性肽具有藥用活性高、生物利用性好、副作用少等優(yōu)點。因此活性肽的開發(fā)利用引起了各國科學家包括有機化學家、生物化學家、藥物化學家、結構化學家等與生命科學有關的科學家的高度重視，近幾年，其已發(fā)展成為國際市場上的一大類重要藥物[4-6]。目前，得到活性肽的途徑多種多樣，本文主要就合成方面對肽進行簡單闡述。

1 肽簡介

兩分子氨基酸經脫水以酰胺鍵聯(lián)接生成的化合物稱為肽。肽分子中的酰胺鍵稱為肽鍵[7]。由兩個氨基酸形成的肽叫二肽，三個氨基酸形成的肽叫三肽，肽分子中的每一個氨基酸部分稱為氨基酸殘基，開鏈狀的肽的自由氨基一端稱為肽鏈的氨基末端或N端，另一端則稱為羧基末端或C端。通常把小于10個氨基酸殘基的肽稱為寡肽或小分子肽，10～80(或100)個氨基酸殘基的肽稱為多肽。

在溫和反應條件下，肽鍵的形成是通過活化一個氨基酸(A)的羧基部分，第二個氨基酸(B)則親核進攻活化羧基部分而形成二肽。如果羧基組分(A)的氨基未保護，肽鍵的形成則不可控制，可能形成線性肽或環(huán)肽等副產物，與目標化合物A-B混在一起。

所以，在肽合成過程中，對不參與肽鍵形成的所有官能團必須用暫時、可逆的方式予以保護，即每一個肽鍵的形成，包括三個步驟：第一步，對縮合反應中不參與反應的活性部分進行保護；第二步， N-保護氨基酸的羧基必須先活化為活性中間體，隨后于羧基保護的氨基酸進行縮合形成肽鍵；第三步，對保護基進行選擇性脫除或全脫除。

2 氨基酸保護

2.1氨基保護及脫保護 用于氨基保護的保護基數(shù)目很多，按其結構可分為烷氧羰基、酰基、烷基三大類。烷氧羰基是目前應用最廣的氨基保護基。表1列舉了幾種有代表性的烷氧羰基保護基及脫保護條件。

2.2羧基保護及脫保護 目前已知的大多數(shù)羧基保護基是由一級、二級，或三級醇制備的酯。表2列舉了幾種常見的羧基保護基。

表1 氨基保護基及脫保護條件

表2 代表性的羧基保護基

2.3側鏈官能團保護 在氨基酸縮合反應中，由于不少氨基酸的側鏈上都帶有易參與反應的活性基團，如羥基、巰基、酚基、胍基、咪唑基、吲哚基等。為了避免副反應的發(fā)生，在多肽合成中往往也選用適當?shù)谋Ｗo基將其保護起來。表3列出了幾個側鏈官能團的常用保護基及脫保護條件。

表3 側鏈保護基及脫除條件

2.4保護基的匹配 對于用在一個特定肽合成的各種不同類型的保護基，保護基的選擇必須具備正交性，正交的意思就是每一類保護基的脫除各不相干。因此，為獲得最佳正交性，各個化學裂解機制應該是不同的。

3 肽鍵的生成方法

3.1酰基疊氮物法 早在1902年，就有人將酰基疊氮物法引入到肽化學中，因此，該方法是最古老的縮合方法之一，在肽縮合反應過程中，疊氮物法對氨基酸很少發(fā)生消旋作用，因此，該方法一直被肽合成工作者廣泛使用。最近我國學者李勤耕等[23]利用此種方法成功合成出一系列谷氨酰胺類抗腫瘤化合物。

疊氮法接肽分為三步，首先，羧基部分被甲酯、乙酯、芐酯等保護的肽在室溫下進行肼解生成酰肼，然后酰肼在低溫(-15 ℃以下)和酸性條件下與亞硝酸化物反應生成疊氮物，最后用有機堿調節(jié)pH 8～9，加入氨基組分完成接肽反應。機理如圖1。

圖1 疊氮法接肽反應機理

除此以外，人們還發(fā)現(xiàn)了一種磷酸酯型縮合試劑DPPA，其可以不經肼解，直接由羧基變成疊氮鹽。與傳統(tǒng)疊氮物法相比，由于其不需要酰肼中間體，簡化了反應步驟，而且反應條件更加溫和，因此受到人們的歡迎。機理如圖2。

圖2 DPPA接肽機理

3.2混合酸酐法 該方法是指先將保護的氨基酸的羧基制成高活性的混合酸酐，之后與氨基縮合生成肽的方法?；旌纤狒ㄊ巧鲜兰o50年代初期開始發(fā)展起來的，開始使用的制備混合酸酐的試劑主要是二苯基磷酸，然后是苯甲酸，現(xiàn)在應用最廣的是氯甲酸烷基酯類，主要有氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯和氯甲酸異丙酯?；旌纤狒ň哂蟹磻俣瓤?、產物純度高、產率高、經濟性好等優(yōu)點，因此備受當今藥學工作者的厚愛。南京農業(yè)大學宓鵬程等人[24]于2007年成功利用此法合成出了胸腺五肽(TP5)中間體Fmoc-Tyr(t-Bu)-WangResin 。

反應過程中，羧基組分首先與氯甲酸異丁酯在低溫下(-15 ℃左右)反應生成混合酸酐，然后在叔胺存在的堿性條件下與氨基組分反應生成肽。反應機理如圖3所示。

圖3 混合酸酐法接肽機理

3.3碳二亞胺法 在碳二亞胺法類方法發(fā)展過程中，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)首先用于肽合成，并且得到廣泛應用，DCC相對便宜，而且可溶于肽合成常用試劑，但是用DCC作縮合劑會有二環(huán)己基脲(DCU)生成，DCU在水中和有機溶劑中均有一定的溶解度，致使在產物純化過程中很難將其除盡。為此人們開發(fā)了水溶性的碳二亞胺EDC來代替DCC，反應完后只需要用酸或水洗滌即可除去反應生成的脲，有效的解決了這個問題。劉國都等[25]在合成活性三肽法氏囊素中也用到此方法。

碳二亞胺類的縮合試劑機理如圖4，縮合試劑先與羧基組分生成活性中間體，然后再與胺基組分在堿性條件下完成肽鏈增長反應。

圖4 碳二亞胺偶合反應機理

3.4酰鹵法 該法類似于有機化學方法，用酰氯活化羧基，然后在室溫或低溫條件下形成酰胺，是一種常用的方法。然而，此種方法在試劑應用中只用于Fmoc-保護的氨基酸，原因在于Fmoc在酸性條件下非常穩(wěn)定，而其他保護基保護的氨基酸很少用該法進行合成，因為多數(shù)學者認為酰氯法“過度活潑”且易發(fā)生消旋等多種副反應。

3.5苯并三唑型(BOP族) 以BOP為第一代苯并三唑型的縮合試劑可以說是縮合試劑里的一場革命，因為其接肽的效率要遠遠高于DCC，引起消旋的風險也明顯減小。之后，人們又發(fā)現(xiàn)了同類型的縮合試劑HBTU、ByBOP、TBTU等。其共同點就是縮合試劑在有機堿的參與下先與羧基組分反應，生成羧酸的苯并三唑酯活性中間體，然后再與氨基組分反應生成目標多肽，如圖5所示。

圖5 BOP族縮合試劑接肽機理

4 結語

目前, 多肽類藥物涉及激素、神經細胞生長和生殖等各生命領域并有直接影響細胞分化、神經質傳遞、腫瘤病變和免疫調節(jié)等多種重要功能[26]。據有關方面報道，2008年，全球多肽類藥物總銷售額已達750～800億美元，每年還以20%的速度快速增長，肽類藥物已經成為國際醫(yī)藥市場上的亮點。鑒于此,本文在查閱大量文獻的基礎上，對多肽常見的合成方法進行了歸納總結,希望以此推動肽類藥物在治療疾病中的應用。

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