朱春暉,謝 勇,呂農(nóng)華#
1)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部南昌330006 2)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化研究所南昌330006
抗代謝藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種在腫瘤治療中經(jīng)常使用的化療藥物,其本身是無活性的,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5-fluoro-2-deoxyuridine 5-monophosphate,5-FdUMP)等活性代謝產(chǎn)物[1],在 RNA 和 DNA 代謝中發(fā)揮作用[2-4]。作者觀察了5-FU對(duì)胰腺癌sw1990細(xì)胞增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討5-FU抗腫瘤作用的潛在機(jī)制。
1.1 材料 胰腺癌sw1990細(xì)胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院屠振興教授惠贈(zèng)。主要試劑:5-FU(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)、Trizol、M-MLV、dNTP、OligodT(15)、RNasin(Promega公司);無核酶水;Mastermix(Tiangen);石蠟油;無水乙醇;異丙醇;氯仿;總蛋白提取試劑盒(北京普利萊公司);各種抗體(Santa Cruz公司);熒光試劑盒(Pierce公司);DMEM(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青公司);瓊脂糖 (Amresco公司);其余試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)分組 按6×3析因設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。因素1 為 5-FU 劑量,包括 0、50、100、200、400 和 800 mg/L共6個(gè)水平。因素2為作用時(shí)間,包括24、48和72 h 3個(gè)水平。使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中,按上述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)sw1990細(xì)胞分組進(jìn)行孵育培養(yǎng),0.5 g/L胰酶消化貼壁生長的細(xì)胞進(jìn)行傳代[5]。
1.3 觀測(cè)指標(biāo)
1.3.1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)。胰酶消化后收集細(xì)胞,每組細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞覆蓋率達(dá)70% ~80%后吸出培養(yǎng)基。每孔加入MTT溶液(5 g/L溶于PBS)20 μL,37℃孵育4 h。吸棄上清液,每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min,使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解,于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上在490 nm波長處測(cè)定吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=(對(duì)照孔A-實(shí)驗(yàn)孔A)/(對(duì)照孔A-空白孔A)×100%。
1.3.2 p53、bax及 pten mRNA 檢測(cè) 采用 RT-PCR法。分別收集各組細(xì)胞,按 Trizol試劑盒說明提取總RNA,15 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見5S、18S、28S共3個(gè)條帶,RNA樣品經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定,A(260 nm)/A(280 nm)比值在 1.8 ~2.0,適用于下一步實(shí)驗(yàn),適用于下一步實(shí)驗(yàn)。RT-PCR按Promega試劑盒說明操作。引物序列及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,用Bandscan圖像分析軟件進(jìn)行吸光度積分值分析,以目的基因與內(nèi)參照β-actin條帶吸光度積分值之比作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
表1 引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物大小
1.3.3 P53、BAX、PTEN 及磷酸化 AKT(p-AKT)蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。分別收集各組細(xì)胞,蛋白提取及定量參照文獻(xiàn)[5]。樣品經(jīng)凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移后膜封閉1 h,加入封閉液稀釋的一抗(1∶200),結(jié)合2 h,加封閉液稀釋的二抗 (1∶1 000),反應(yīng)1.5 h。以β-actin為參照。ECL顯色,X線膠片曝光,顯影、定影,拍照保存,讀取各條帶A值,以目的蛋白與β-actin條帶的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理5-FU作用時(shí)間和劑量對(duì)sw1990細(xì)胞增殖抑制率及凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的作用采用析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行評(píng)價(jià),采用t或t’檢驗(yàn)比較5-FU處理及未處理對(duì)sw1990細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。
2.1 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果 見表2??梢钥闯?,各劑量5-FU作用后sw1990細(xì)胞增殖抑制率隨作用時(shí)間延長均有所增大。
表2 不同劑量5-FU作用不同時(shí)間后sw1990細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果(n=6)%
2.2 p53、bax、pten mRNA 檢測(cè)結(jié)果 見圖1~3和表3~5。
圖1 不同劑量5-FU作用24(左)、48(右)及72 h(右)后sw1990細(xì)胞p53 mRNA的表達(dá)
表3 不同劑量5-FU作用不同時(shí)間后sw1990細(xì)胞p53 mRNA的表達(dá)(n=6)
圖2 不同劑量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990細(xì)胞bax mRNA的表達(dá)
表4 不同劑量5-FU作用不同時(shí)間后sw1990細(xì)胞bax mRNA的表達(dá)(n=6)
圖3 不同劑量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990細(xì)胞pten mRNA的表達(dá)
表5 不同劑量5-FU作用不同時(shí)間后sw1990細(xì)胞pten mRNA的表達(dá)(n=6)
2.3P53、BAX、PTEN 及 p-AKT 蛋白檢測(cè)結(jié)果MTT分析及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,5-FU作用后sw1990細(xì)胞增殖明顯受到抑制,但隨著5-FU劑量的增高和作用時(shí)間的延長,雖然增殖抑制作用更加明顯,但是凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)無明顯增高,因此,綜合考慮藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用,選擇50 mg/L 5-FU作用24 h為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行相關(guān)蛋白的檢測(cè)。結(jié)果見圖4和表6。
圖4 50 mg/L 5-FU作用24 h后sw1990細(xì)胞P53、BAX、PTEN和p-AKT蛋白的表達(dá)
表6 P53、BAX、PTEN及p-AKT蛋白檢測(cè)結(jié)果
抗代謝藥物5-FU是一種在腫瘤治療中經(jīng)常使用的化療藥物,自從40年前Heidelberger首次合成以來一直是治療實(shí)體腫瘤最有效的抗腫瘤藥物。該研究結(jié)果顯示,5-FU能顯著抑制胰腺癌sw1990細(xì)胞的增殖,這種抑制作用具有劑量依賴性,并隨作用時(shí)間的延長而有所增強(qiáng)。一般情況,細(xì)胞通過線粒體介導(dǎo)通路和膜死亡受體介導(dǎo)通路來調(diào)控凋亡。該研究結(jié)果表明,5-FU作用后sw1990細(xì)胞p53、bax、pten mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)上調(diào)。5-FU作用后通過誘導(dǎo)p53 ser42磷酸化,從而上調(diào)P53AIP1的表達(dá),促進(jìn)p53轉(zhuǎn)錄,增高P53蛋白水平[6];同時(shí),低濃度5-FU能誘導(dǎo)諸如rRNA生物合成斷裂的核糖體應(yīng)激,將核糖體蛋白從細(xì)胞核中解離出來,與MDM2結(jié)合,解除 MDM2對(duì) p53的抑制,同時(shí)也能通過ATM和c-Abl激酶誘導(dǎo)MDM2的磷酸化,并抑制p53降解[7-8]。p53表達(dá)上調(diào)后可促 p21waf1/cip1、bax、puma等的表達(dá),下調(diào)p-AKT蛋白的表達(dá),觸發(fā)了級(jí)聯(lián)的下游事件,包括線粒體膜電位的崩潰,凋亡基因的線粒體蛋白細(xì)胞色素C(Cytc)和SMAC的釋放,線粒體膜發(fā)生改變,Cytc及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等釋放入胞質(zhì),與胞質(zhì)中的凋亡活化因子結(jié)合,繼而活化 caspase-3、6、8 和9[9]及包括 FasL[10]和 fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白[11]在內(nèi)的促凋亡基因,裂解大量底物(包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)蛋白等)。與此同時(shí),5-FU誘導(dǎo)p53表達(dá)后能促進(jìn)caspase-3和Bid的活化,并通過與Bcl-2蛋白家族有關(guān)的信號(hào)通路增加其誘導(dǎo)凋亡的能力[12],最終通過線粒體介導(dǎo)通路和膜死亡受體介導(dǎo)通路發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用。
Klampfer等[13]研究表明致癌的 Ras信號(hào)能在體內(nèi)促進(jìn)5-FU作用后p53的積聚及其在絲氨酸15的磷酸化,從而促進(jìn)凋亡而非生長停滯[13]。眾所周知,胰腺癌細(xì)胞中Ras過表達(dá),這是否在5-FU對(duì)胰腺癌細(xì)胞的p53誘導(dǎo)中發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。
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