丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和核酸內(nèi)切酶G的影響

張會芳，盧 宏#，焦淑潔，劉 希

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:腦血管及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和核酸內(nèi)切酶G的影響

張會芳1)，盧 宏1)#，焦淑潔1)，劉 希2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:腦血管及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

瞬時(shí)感受器電位M2型;核酸內(nèi)切酶G;慢性腦缺血;丁基苯酞;大鼠

目的:研究丁基苯酞(NBP)對老齡大鼠慢性腦缺血腦組織瞬時(shí)感受器電位M2型(TRPM2)及核酸內(nèi)切酶G(EndoG)表達(dá)的影響。方法:80只老齡Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為假手術(shù)組、模型組、NBP低劑量治療組和NBP高劑量治療組。采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎建立慢性腦缺血模型。3個(gè)月后，HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化SP法染色檢測TRPM2和 EndoG的表達(dá)變化。結(jié)果:各組大鼠腦皮層與海馬區(qū)組織TRPM2和EndoG表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=310.046、127.115、49.959和80.292，P均＜0.05)。模型組皮質(zhì)和海馬TRPM2、EndoG表達(dá)較假手術(shù)組增多(P＜0.05)，而NBP低劑量和高劑量治療組較模型組減少(P＜0.05)，NBP高劑量組較低劑量治療組降低更加明顯(P＜0.05)。結(jié)論:NBP可能通過下調(diào)TRPM2和EndoG的表達(dá)，抑制細(xì)胞損傷和死亡，發(fā)揮對慢性缺血性腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用。

慢性腦缺血是指各種原因?qū)е麓竽X長期廣泛的血供不足，引發(fā)腦細(xì)胞缺血缺氧而出現(xiàn)的一系列神經(jīng)功能障礙性疾病。瞬時(shí)感受器電位M2型(transient receptor potential melastain 2，TRPM2)是位于細(xì)胞膜上的一類重要的非谷氨酸依賴的鈣離子通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，能在免疫反應(yīng)中調(diào)控胞內(nèi)的鈣離子濃度［1］。核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，EndoG)是一種鈣離子依賴性內(nèi)切酶，活化的EndoG自線粒體中釋放入胞質(zhì)后，繼而轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核引起染色體DNA斷裂，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)是中國成功研制的治療急性缺血性卒中的一種化學(xué)新藥，能改善腦卒中后病灶周圍微循環(huán)、保護(hù)線粒體、抑制炎癥反應(yīng)、阻斷鈣內(nèi)流等［3］，對急性腦缺血療效肯定，但在慢性腦缺血中是否能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用尚未見報(bào)道。作者建立慢性腦缺血動物模型，旨在觀察丁基苯酞對老齡大鼠腦組織中TRPM2和EndoG蛋白表達(dá)的影響，探討丁基苯酞對慢性腦缺血組織的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為慢性腦缺血的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 兔抗TRPM2多克隆抗體購自美國Novus公司;兔抗EndoG多克隆抗體購自北京博奧森;SP和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NBP(批號:050106)由恩必普藥業(yè)提供。

1.2 慢性腦缺血大鼠模型的建立 參照Ohta等［4］方法制作大鼠慢性腦缺血模型。手術(shù)前12 h禁食，術(shù)后4 h禁水。大鼠腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中線切開，分離雙側(cè)頸總動脈，雙重絲線結(jié)扎(2VO手術(shù))。棄去術(shù)中出現(xiàn)呼吸困難、出血過多的大鼠。2VO術(shù)后飼養(yǎng)過程中，表現(xiàn)活潑，行動自如，正常攝食飲水，毛色光潔，眼部無異常分泌物，體質(zhì)量增加為模型成功。凡手術(shù)后3個(gè)月后死亡的大鼠不計(jì)在內(nèi)。

1.3 動物分組與處理 健康Wistar大鼠80只，雌雄不拘，鼠齡12～14個(gè)月，體質(zhì)量450～550 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠分為4組，每組20只。A組:除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，余同1.2;B組:模型組;C組:NBP低劑量治療組;D組:NBP高劑量治療組。C組和D組2VO術(shù)后2個(gè)月分別按60 mg/kg和120 mg/kg每天給予NBP灌胃，A組和B組每給予消毒后的精制花生油2 mL灌胃，皆灌1個(gè)月。1個(gè)月后，以水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟和主動脈弓，經(jīng)左心室以200 mL生理鹽水加壓快速沖洗，斷頭取腦，隨后置于40 g/L多聚甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋。

1.4 腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察 腦組織切片經(jīng)蒸餾水沖洗后，HE染色，光鏡下觀察。

1.5 腦組織TRPM2和EndoG蛋白的檢測 采用免疫組織化學(xué)SP法。TRPM2和EndoG兔多克隆抗體分別按1∶70和1∶30稀釋，嚴(yán)格按照說明書操作。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性標(biāo)本作為陽性對照。TRPM2蛋白陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色，主要分布于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。EndoG蛋白陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物也呈棕黃色或棕褐色，主要分布于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取6張切片，在皮層和海馬各隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(× 400)，彩色病理圖像分析儀采集圖像，圖像分析系統(tǒng)，分析TRPM2與EndoG平均積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析，各組腦組織TRPM2和EndoG蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài) A組大鼠顳葉皮層和海馬神經(jīng)元大部分形態(tài)正常，神經(jīng)元排列緊密，神經(jīng)元胞核圓、藍(lán)色著色，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞體完整，偶見變性和死亡神經(jīng)元。B組大部分神經(jīng)元消失，胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，呈現(xiàn)深藍(lán)著色，在細(xì)胞核周圍可見空穴，正常神經(jīng)元數(shù)目較少，排列紊亂，有的胞質(zhì)不均勻，內(nèi)有空泡。C組大鼠顳葉皮層和海馬神經(jīng)元較B組消失減少，可見部分變性和死亡神經(jīng)元。D組雖然在大鼠顳葉皮層和海馬可以發(fā)現(xiàn)小部分變性和死亡神經(jīng)元，但是其組織形態(tài)較B組有明顯的好轉(zhuǎn)，較C組也有部分改善。見圖1。

圖1 各組大鼠皮質(zhì)(1)和海馬區(qū)(2)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

2.2 各組大鼠腦組織TRPM2和EndoG蛋白的表 達(dá) 見圖2、表1。

圖2 各組大鼠海馬和皮層中TRPM2和EndoG蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 各組大鼠海馬和皮層中TRPM2及EndoG積分光密度值比較

3 討論

慢性腦缺血損傷中會產(chǎn)生活性氧及氮類物質(zhì)，而神經(jīng)細(xì)胞過度暴露于以上物質(zhì)，則會發(fā)生類似凋亡的遲發(fā)性死亡和壞死［5］。TRPM2是一種廣泛分布于細(xì)胞膜上非谷氨酸依賴的Ca2+選擇性的陽離子通道，為瞬時(shí)受體電位通道超家族中的一員［6］。TRPM2的生理作用極可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度而實(shí)現(xiàn)的。其在氧化應(yīng)激中充當(dāng)正反饋信號［1］，其在氧化應(yīng)激或氧-葡萄糖剝離狀態(tài)下DNA損傷和修復(fù)過程中產(chǎn)生大量的ADP-核糖，此物質(zhì)能激活TRPM2通道。最初認(rèn)為TRPM2通道僅存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，后來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞膜中也表達(dá)此類通道蛋白［4］。有研究［7］表明，TRPM2通道的激活與細(xì)胞死亡率之間呈現(xiàn)正相關(guān)。在體外試驗(yàn)中以反義RNA下調(diào)TRPM2基因表達(dá)，或是培養(yǎng)TRPM2基因缺陷細(xì)胞，都可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率上升［8］。因此有人認(rèn)為TRPM2通道抑制劑也許能改善炎癥/缺血中的細(xì)胞存活率，但目前尚未發(fā)現(xiàn)TRPM2的特異抑制劑［4］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性腦缺血能誘導(dǎo) TRPM2表達(dá)，而NBP可劑量依賴性下調(diào)TRPM2蛋白的表達(dá)，這可能與NBP抑制炎癥反應(yīng)，減少ADPR、H2O2等 TRPM2通道激活物質(zhì)的生成，從而抑制TRPM2通道的活化及在ROS/RAS中的正反饋?zhàn)饔糜嘘P(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

EndoG是一種由核基因編碼的存在于真核細(xì)胞線粒體膜間區(qū)的鈣離子依賴性核酸酶，主要與DNA修復(fù)和線粒體 DNA復(fù)制相關(guān)［9］。EndoG為非caspase依賴的線粒體蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［10］。胞質(zhì)鈣離子濃度升高被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的啟動因素之一。韓恩吉等［11］在鈣載體和PC12細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中再次證實(shí)了胞質(zhì)鈣離子升高-激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶-DNA在核小體間斷裂-神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程。Caspase依賴性機(jī)制在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［12］，但caspase非依賴性機(jī)制也參與了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡［13］。正常情況下EndoG在腦組織中僅少量表達(dá)于衰老細(xì)胞中。在促凋亡因素(如tBid、Bax、鈣及化療藥物)的刺激下，線粒體膜的通透性增加，定位于線粒體膜間隙的EndoG轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)，進(jìn)而進(jìn)入胞核，引起染色體DNA斷裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。該實(shí)驗(yàn)中，模型組中大鼠腦組織可觀察到大量的EndoG陽性細(xì)胞，提示慢性缺血能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)EndoG途徑凋亡，予以NBP干預(yù)后EndoG蛋白表達(dá)水平劑量依賴性下降，推測NBP可能通過某種途徑保護(hù)線粒體，減少線粒體APT通道的開放，從而抑制EndoG從線粒體釋放及轉(zhuǎn)位，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NBP可能通過某種途徑抑制TRPM2通道蛋白的活化，減輕非谷氨酸依賴的鈣離子通道所介導(dǎo)的鈣超載，減少線粒體APT通道的開放，進(jìn)而減少線粒體中內(nèi)源性EudoG的釋放，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

［1］吳航宇，梁華平.TRP離子通道在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用［J］.中國急救醫(yī)學(xué)雜志，2009，29(10):944

［2］Lorenzo HK，Susin SA.Mitochondrial effectors in caspaseindependent cell death［J］.Febs Letters，2004，557(1/ 3):14

［3］ Chong ZZ，F(xiàn)eng YP.Dl-3-n-butylphthalide attenuates reperfusion-induced blood-brain barrier damage after focal cerebral ischemia in rats［J］.Zhongguo Yao Li Xue Bao，1999，20(8):696

［4］Ohta H，Nishikawa H，Kimura H，et al.Chronic cerebral hypoperfusion by permanent internal carotid ligation produces learning impairment without brain damage in rats［J］.Neuroscience，1997，79(4):1039

［5］Naziroglu M.TRPM2 cation channels，oxidative stress and neurological diseases:where are we now?［J］.Neurochem Res，2011，36(3):355

［6］Ikonomidou C，Turski L.Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury?［J］.Lancet Neurol，2002，1(6):383

［7］Partida-Sanchez S，Cockayne DA，Monard S，et al.Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release，extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo［J］.Nat Med，2001，7(11):1209

［8］Hou ST，MacManus JP.Molecular mechanisms of cerebral ischemia-induced neuronal death［J］.Int Rev Cytol，2002，221:93

［9］LI LY，Luo X，Wang X.Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondia［J］.Nature，2001，412(6842):95

［10］Hara Y，Wakamori M，Ishii M，et al.LTRPC2 Ca2+permeable channel activated by changes in redox status confers susceptibility to cell death［J］.Mol Cell，2002，9(1):163

［11］韓恩吉，韓淑英.神經(jīng)細(xì)胞凋亡與胞漿鈣離子［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1999，16(3):131

［12］Ishitsuka K，Hideshima T，Hamasaki M，et al.Novel inosine monophosphate dehydrogenase inhibitor VX-944 induces apoptosis in multiple myeloma cells primarily via caspaseindependent AIF/Endo G pathway［J］.Oncogene，2005，24 (38):5888

［13］Kim JS，Lee JH，Jeong WW，et al.Reactive oxygen species-dependent EndoG release mediates cisplatin-induced caspase-independent apoptosis in human head and neck squamous carcinoma cells［J］.Int J Cancer，2008，122 (3):672

［14］Wang X.The expanding role mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，2001，15(22):2922

Effects of dl-butylphthalide on expressions of TRPM2 and EndoG in brain tissues of aged rats with chronic cerebral ischemia

ZHANG Huifang1)，LU Hong1)，JIAO Shujie1)，LIU Xi2)1)Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Department of Neurology，the Fifth Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

transient receptor potential melastain 2;endonuclease G;chronic cerebral ischemia;dl-butylphthalide;rat

Aim:To investigate the influences of dl-butylphthalide(NBP)on the expressions of transient receptor potential melastain 2(TRPM2)and endonuclease G(EndoG)after chronic cerebral ischemia in aged rats.Methods:A total of 80 aged male Wistar rats were randomly divided into 4 groups，sham-operated group，model group，low-dose NBP-treated group and high-dose NBP-treated group.Chronic cerebral ischemia model was based on permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries.The rats were sacrificed after 3 months.The changes of morphology of brain were observed by HE staining and the expressions of TRPM2 and EndoG were observed by immunohistochemistry.Results:The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of the four groups were significantly different(F=310.046，127.115，49.959，and 8.292，P＜0.05).The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of model group were more than those of shamoperated group，and those of low and high dose NBP-treated groups were significantly less than those of model group(P＜0.05)，and the high dose group changed more apparently.Conclusion:NBP may have neuroprotective effects，which may result from its decreasing the expression of TRPM2 and EndoG after chronic ischemia，thus inhibiting the injury and death of the cells.

R743

(2011-03-15收稿 責(zé)任編輯李沛寰)