杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基stt3a酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)*

侯永杰，李 杰，李慶華，王建人，薛樂(lè)勛#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)河南中醫(yī)學(xué)院生理教研室鄭州 450008

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基stt3a酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)*

侯永杰1)，李 杰1)，李慶華1)，王建人2)，薛樂(lè)勛1)#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001 2)河南中醫(yī)學(xué)院生理教研室鄭州 450008

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;stt3a;酵母雙雜交;鞭毛再生

目的:觀察杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基stt3a的酵母雙雜交誘餌載體表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞有無(wú)毒害作用并檢測(cè)其自激活作用。方法:應(yīng)用PCR方法獲得stt3a可溶端的基因片段，將基因片段按正確的方向插入到酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7中，經(jīng)限制性內(nèi)酶切鑒定正確后，用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，并通過(guò)表型篩選檢測(cè)誘餌蛋白有無(wú)毒性和自激活作用。結(jié)果:成功獲得了stt3a可溶端的基因片段，其表達(dá)的蛋白對(duì)酵母菌株Y187無(wú)毒害，報(bào)告基因-半乳糖苷酶活性沒(méi)有被誘導(dǎo)。結(jié)論:酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)可以被用來(lái)研究杜氏鹽藻中與stt3a相互作用的蛋白。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一個(gè)研究蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)平臺(tái)，由于是在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，因此能夠在某種程度上反映蛋白質(zhì)在正常生理?xiàng)l件下的活性狀態(tài)，這是體外任何實(shí)驗(yàn)無(wú)法模擬的。stt3a基因是寡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，可以有效促使新生肽的糖基化修飾［1-2］，它在已知的寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基中是最保守的［3］。最近的研究［4］發(fā)現(xiàn)擬南芥的stt3a作為寡糖基轉(zhuǎn)移酶的亞基在高滲透壓的應(yīng)激或高鹽反應(yīng)中發(fā)揮作用。杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻，能在0.5～5.0 mol/L NaCl條件下生存。作者擬通過(guò)構(gòu)建鹽藻 stt3a酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-stt3a，轉(zhuǎn)化酵母菌株，檢測(cè)其對(duì)酵母菌株有無(wú)毒性作用并進(jìn)行自激活檢測(cè)，為進(jìn)一步研究杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制和stt3a作為一種跨膜蛋白直接或間接參與杜氏鹽藻鞭毛再生過(guò)程中所需相關(guān)蛋白的糖基化修飾［5］，提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、載體與菌株 杜氏鹽藻藻株為UTEXLB-1644，購(gòu)自美國(guó)得克薩斯州大學(xué)，載體pMD19-T、表達(dá)載體pGBKT7、AH109和Y187酵母菌株均購(gòu)自大連寶生物工程公司，DH5α為鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。

1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司;酵母培養(yǎng)基購(gòu)自上海睿星基因技術(shù)有限公司;LiAc溶液購(gòu)自Clontech公司;X-α-Gal和3-AT均購(gòu)自Sigma公司;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生物公司;PCR儀(Biometra公司)，電泳儀(北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠)，凝膠成像儀(Synoptics公司)，2-16P型離心機(jī)(Heraeus公司)。1.3 stt3a基因的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增基因stt3a可溶端的特異性引物:上游引物序列5’-CCGGAAT TCATGTCCTCGCCGTCCATCGTG-3’，下游引物序列5’-CGCGGATCCATGTCATGCCTTGGCCTTGGC-3’。100 μL PCR反應(yīng)體系中LA Taq酶0.5 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 nmol/L)8 μL，10×LA Buffer 10 μL，模板 cDNA 1 μL，加ddH2O至100 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆和鑒定 PCR產(chǎn)物膠回收后與克隆載體pMDT-19相連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確的陽(yáng)性克隆為pMDT-19-stt3a，然后序列分析其正確性。

1.5 構(gòu)建載體及鑒定誘餌載體 用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切 pMDT-19-stt3a和表達(dá)載體 pGBKT7，膠回收后的stt3a和表達(dá)載體pGBKT7片段，將載體片段和stt3a連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，將含正確片段的克隆命名為pGBKT7-stt3a，然后鑒定序列的正確性。

1.6 pGBKT7-stt3a的轉(zhuǎn)化

1.6.1 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞 挑取單克隆酵母菌Y187，接種于5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃以230～250 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h，至A(600 nm)= 0.15～0.30后接種于50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃以250 r/min振蕩培養(yǎng)至A(600 nm)=0.4～0.5 (約3 h)。室溫下將含有酵母的液體培養(yǎng)基以2 700 r/min離心5 min。棄上清，加50 mL去離子水重懸沉淀。離心棄上清，用3 mL 1×TE/LiAc溶液重懸，分裝于1.5 mL的微量離心管中，12 000 r/min離心30 s，再用600 μL 1×TE/LiAc重懸，所得的懸浮液即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.6.2 轉(zhuǎn)化及鑒定 在1.5 mL微量離心管中，加入50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞，已構(gòu)建好的誘餌載體0.5 μL(同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照)，500 μL PEG/Li-Ac溶液和鯡魚(yú)精DNA 5 μL，渦旋均勻。在30℃水浴中培養(yǎng)30 min，加入20 μL二甲基亞砜(DMSO)混勻，42℃水浴20 min，每5 min混勻1次。2 700 r/ min離心5 min，棄上清，用1 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30℃水浴振蕩培養(yǎng)90 s，離心棄上清，用9 g/ L的NaCl輕輕重懸，鋪于SD/-Trp平板。于30℃培養(yǎng)3～5 d，直至帶有誘餌載體的酵母長(zhǎng)出克隆。

1.7 誘餌蛋白自激活檢測(cè) 空載體質(zhì)粒pGBKT7-BD和重組質(zhì)粒pGBKT7-stt3a分別轉(zhuǎn)到酵母AH109和Y187中，再將轉(zhuǎn)有質(zhì)粒的酵母細(xì)胞鋪在不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基培養(yǎng)平板 SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal上，30℃培養(yǎng)3～6 d，觀察酵母生長(zhǎng)狀況。

1.8 誘餌蛋白的毒性檢測(cè) 將空質(zhì)粒pGBKT7-BD和重組質(zhì)粒pGBKT7-stt3a分別轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞，30℃于SD/-Trp培養(yǎng)板培養(yǎng)?？寺￠L(zhǎng)出后挑取直徑2～3 mm的單克隆菌落至含抗生素Kan+的液體培養(yǎng)基SD/-Trp中，30℃搖蕩培養(yǎng)，測(cè)定A(600 nm)為0.15左右時(shí)，取10 μL用9 g/L的NaCl稀釋至相同的濃度后，再各取5 μL至新培養(yǎng)基中搖蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定其A(600 nm)的值，重復(fù)測(cè)定2次取平均值繪制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 重組pGBKT7-stt3a質(zhì)粒的酶切鑒定 杜氏鹽藻 stt3a基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。連接到 pMDT-19stt3a雙酶切后(圖2)，將酶切回收后的stt3a插入到表達(dá)載體 pGBKT7上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，送測(cè)序后發(fā)現(xiàn)無(wú)堿基突變和移碼突變，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定pGBKT7-stt3a重組質(zhì)粒，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，酶切鑒定結(jié)果(圖3)與實(shí)際相符，載體構(gòu)建成功。

2.2 誘餌載體pGBKT7-stt3a的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化pGBKT7-stt3a的酵母細(xì)胞Y187的 PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 重組菌落pGBKT7-stt3a的PCR鑒定

2.3 誘餌載體的自激活作用檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 誘餌蛋白的自激活檢測(cè)結(jié)果

2.4 誘餌蛋白的毒性檢測(cè) 空質(zhì)粒酵母pGBKT7細(xì)胞和誘餌重組質(zhì)粒酵母細(xì)胞pGBKT7-stt3a的生長(zhǎng)曲線從圖5上看基本一致。

圖5 酵母菌的生長(zhǎng)曲線

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)是通過(guò)寡糖基轉(zhuǎn)移酶這一門(mén)戶分泌到其發(fā)揮功能的部位，它是由一接納體Asn-XSer/Thr(X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)來(lái)決定其特異性。stt3作為寡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，它有一個(gè)Ncyt-Clum拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，含有DK與WWDYG兩個(gè)保守的基序［6］，含有11個(gè)跨膜螺旋［7］。在植物中stt3a作為寡糖基轉(zhuǎn)移酶的亞基，能通過(guò)含有stt3a的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物介導(dǎo)特殊蛋白質(zhì)的糖基化，這些蛋白質(zhì)是鹽耐受性所必需的［8-9］。杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制到目前還沒(méi)有完全弄清楚，初步的研究［2］表明，杜氏鹽藻的耐鹽機(jī)制除受到有關(guān)離子和丙三醇調(diào)節(jié)外，還受到一些糖基化的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)。在高鹽條件下，杜氏鹽藻的運(yùn)動(dòng)性明顯降低，隨著鹽濃度的升高，stt3a與mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，用stt3a作為誘餌釣取與之相關(guān)的基因，能更有說(shuō)服力地闡述stt3a及與其相互作用的基因參與鹽藻的耐鹽機(jī)制，也可能會(huì)進(jìn)一步地闡述清楚鹽藻耐鹽的分子機(jī)制和調(diào)控途徑。

stt3a還直接或間接地參與了鹽藻鞭毛的再生［5］。因此，運(yùn)用酵母雙雜交的方法篩選與stt3a相互作用的蛋白可能有利于闡述stt3a基因作為跨膜蛋白對(duì)調(diào)節(jié)鞭毛再生和適應(yīng)高鹽濃度的分子機(jī)制。酵母雙雜交系統(tǒng)是由Fields等［10］提出建立的一種新的直接在真核活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白相互作用的新方法，靈敏度高。該實(shí)驗(yàn)是在酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了融合有stt3a基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-stt3a，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，通過(guò)SD/-Trp培養(yǎng)篩選出陽(yáng)性菌落，并通過(guò)毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該外源基因?qū)湍讣?xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。由于假陽(yáng)性存在是酵母雙雜交的最大缺點(diǎn)，主要原因是誘餌蛋白對(duì)報(bào)告基因的激活。為了排除誘餌載體單獨(dú)激活報(bào)告基因而造成假陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)了誘餌載體對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)報(bào)告基因的激活情況，結(jié)果表明stt3a誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187不能激活系統(tǒng)的報(bào)告基因His和lac Z，因此可以用于酵母雙雜交方法釣取與之相互作用的分子。這些為研究杜氏鹽藻參與耐鹽機(jī)制的分子通路和參與鞭毛再生的機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

［1］Frank J，Kaulfürst-Soboll H，Rips S，et al.Comparative analyses of Arabidopsis complex glycan1 mutants and genetic interaction with staurosporin and temperature sensitive3a［J］.Plant Physiol，2008，148(3):1354

［2］Schaewen A，F(xiàn)rank F，Koiwa H.Role of complex N-glycans in plant stress tolerance［J］.Plant Signal Behav，2008，3 (10):871

［3］Chapman A，Li E，Kornfeld S.The biosynthesis of the major lipid-linked oligosaccharide of Chinese hamster ovary cells occurs by the ordered addition of mannose residues［J］.J Biol Chem，1979，254(20):10243

［4］Koiwa H，Li F，McCully MG，et al.The STT3a subunit isoform of the Arabidopsis oligosaccharyltransferase controls adaptive responses to salt/osmotic stress［J］.Plant Cell，2003，15(10):2273

［5］王翠，李杰，柳麗平，等.杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)分析［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26(6):760

［6］Igura M，Maita N，Kamishikiryo J，et al.Structure-guided identification of a new catalytic motif of oligosaccharyltransferase［J］.EMBO J，2008，27(1):234

［7］Kim H，von Heijne G，Nilsson I.Membrane topology of the STT3 subunit of the oligosaccharyl transferase complex［J］.J Biol Chem，2005，280(21):20261

［8］Yan Q，Lennarz WJ.Studies on the function of oligosaccharyltransferase subunits，Stt3p is directly involved in the glycosylation process［J］.J Biol Chem，2002，277(49): 47692

［9］Li J，Lu YM，Xue LX，et al.A structurally novel salt-regulated promoter of duplicated carbonic anhydrase gene 1 from Dunaliella salina［J］.Mol Biol Rep，2010，37(2): 1143

［10］Fields S，Song O.A novel genetic system to detect proteinprotein interactions［J］.Nature，1989，340(6230):245

Construction of yeast two-hybrid bait plasmid for stt3a of oligosaccharyltransferase from Dunaliella salina and detection of self-activation and toxicity of stt3a

HOU Yongjie1)，LI Jie1)，LI Qinghua1)，WANG Jianren2)，XUE Lexun1)1)Laboratory for Cell Biology，Department of Biology，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Physiology，Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008

Dunaliella salina;stt3a gene;yeast two-hybrid;flagella regeneration

Aim:To observe whether expression products of oligosaccharyltransferase subunit stt3a bait plasmid affect the growth of yeast cells and its self-activation.Methods:The cDNA fragments of stt3a were obtained by PCR and then inserted into the plasmid pGBKT7 to construct a recombinant bait plasmid pGBKT7-stt3a.Subsequently，the bait plasmid was transformed into the yeast strain Y187 by PEG/LiAc method.Results:The cDNA fragments of stt3a were amplified successfully.All expression productions were not toxic to Y187 cells and activity of the reporter gene β-galactosidase was not induced.Conclusion:Yeast two-hybrid GAL4 system can be utilized to study proteins interacted on stt3a in Dunaliella salina.

Q782

*科技部國(guó)際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014

(2011-05-03收稿 責(zé)任編輯李沛寰)