非小細(xì)胞肺癌組織中CD68與c-Jun蛋白的表達(dá)*

劉 瑜，王 娜，馮斐斐，燕 貞，王 威，張少鋒，秦麗娟，吳逸明

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年11月生，教授，研究方向:分子腫瘤學(xué)，E-mail:wuym@zzu.edu.cn

非小細(xì)胞肺癌組織中CD68與c-Jun蛋白的表達(dá)*

劉 瑜，王 娜，馮斐斐，燕 貞，王 威，張少鋒，秦麗娟，吳逸明#

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年11月生，教授，研究方向:分子腫瘤學(xué)，E-mail:wuym@zzu.edu.cn

CD68;巨噬細(xì)胞;c-Jun;非小細(xì)胞肺癌;慢性炎癥

目的:探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中CD68和c-Jun蛋白的表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其意義。方法:采用免疫組化SP法檢測67例人NSCLC標(biāo)本(每個標(biāo)本取癌、癌旁和正常組織)中CD68和c-Jun蛋白的表達(dá)，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)檢驗CD68陽性細(xì)胞數(shù)與c-Jun蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:肺癌、癌旁及正常肺組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)依次為11.8±1.4、97.5±2.5和52.1±1.9，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52 334.934，P＜0.001);c-Jun蛋白的平均光密度值依次為0.25±0.03、0.23±0.02和0.20±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=91.280，P＜0.001)。癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)與年齡、性別、病理類型、分化程度、吸煙無關(guān)(P＞0.05)，與TNM分期(F= 158.273，P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(F=84.985，P＜0.001)、是否侵及胸膜(F=16.422，P＜0.001)有關(guān)。癌旁組織中c-Jun蛋白的表達(dá)與年齡、性別、病理類型、吸煙無關(guān)(P＞0.05)，與TNM分期(F=19.319，P＜0.001)、分化程度(F=33.918，P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=12.155，P＜0.001)、是否侵及胸膜(F=8.318，P=0.005)有關(guān)。在癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)與c-Jun蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.519，P＜0.001)。結(jié)論:巨噬細(xì)胞主要浸潤在癌旁組織中，可能通過激活蛋白-1促進(jìn)NSCLC的發(fā)展轉(zhuǎn)移。

有報道［1-2］，多種惡性腫瘤發(fā)生或進(jìn)展與炎癥有關(guān)，而單核-巨噬細(xì)胞浸潤是炎癥發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，單核-巨噬細(xì)胞分泌的多種前致炎因子是炎癥微環(huán)境中不可替代的主要組成成分。激活蛋白-1(activator protein 1，AP-1)被認(rèn)為是“早期即刻基因”和“早期反應(yīng)原癌基因”，直接參與外界各種毒性及致癌性刺激引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增生、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡、肺部防御、炎癥以及免疫反應(yīng)等有關(guān)的基因表達(dá)［3］。目前國內(nèi)外對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor association macrophage，TAM)和AP-1均有研究，但是將兩者聯(lián)合考慮的相關(guān)報道較少，因此作者通過檢測非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的肺癌組織、癌旁組織以及正常組織中巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD68和AP-1亞家族c-Jun的表達(dá)來探討它們與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 67例NSCLC來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月至2009年12月手術(shù)切除標(biāo)本，所有病例術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史，術(shù)后均經(jīng)病理證實。其中男35例，女32例，年齡30～78歲，中位年齡58歲。依據(jù)2004年WHO肺癌的分類標(biāo)準(zhǔn):鱗癌29例，腺癌38例;高分化21例，中分化29例，低分化17例。臨床分期按國際抗癌聯(lián)盟(UICC 2009版)分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期29例，Ⅱ期13例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例;侵及胸膜31例，未侵及胸膜36例;有吸煙史37例，無吸煙史30例。全部標(biāo)本分別在癌組織、癌旁組織以及正常組織(經(jīng)病理學(xué)證實)處取材，福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，每個蠟塊連續(xù)切片6張，切片厚度4 μm。

1.2 c-Jun和CD68蛋白的檢測 采用免疫組化SP法，兔抗人c-Jun多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司，鼠抗人CD68單克隆抗體購于Santa Cruz公司。每個指標(biāo)使用3張切片重復(fù)實驗，染色程序嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，c-Jun和CD68一抗分別按1∶50和1∶10稀釋，每批次染色均用PBS代替一抗作空白對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。應(yīng)用江蘇捷達(dá)科技公司圖像采集分析系統(tǒng)，在高倍鏡下每張切片選取陽性細(xì)胞集中的10個視野采集圖像。CD68采用陽性細(xì)胞計數(shù)法，即計數(shù)10個高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)，求平均值。c-Jun則采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量每個視野下陽性表達(dá)區(qū)域的累積光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行分析，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析和 SNK法比較各組間CD68和c-Jun蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較不同臨床病理特征癌旁組織中CD68和c-Jun蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)量和c-Jun蛋白表達(dá)的相關(guān)性，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺癌、癌旁及正常組織中CD68和c-Jun的表達(dá) 見圖1、表1。CD68蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，染色呈棕黃(褐)色，陽性細(xì)胞多彌散分布在癌巢周圍間質(zhì)及癌旁組織中，正常組織中也有明顯表達(dá)，在癌巢中表達(dá)較少。c-Jun蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，染色呈棕褐(黃)色，癌組織中多為巢狀細(xì)胞著色，癌旁組織中呈片狀表達(dá)，在正常組織中散在分布。

2.2 癌旁組織中CD68和c-Jun的表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表1 NSCLC組織、癌旁組織和正常肺組織中CD68和c-Jun的表達(dá)(n=67)

圖1 肺癌、癌旁和正常組織中CD68(A)和c-Jun(B)蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 癌旁組織中CD68和c-Jun蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)和c-Jun蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性 癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)和 c-Jun蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.519，P＜0.001)。

3 討論

許多研究［4-8］表明:在多種鼠類和人類惡性腫瘤中，包括乳癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及淋巴瘤等，巨噬細(xì)胞的數(shù)量或密度增加與不良預(yù)后有著絕對的關(guān)聯(lián)性。CD68是一種相對分子質(zhì)量為110 000的跨膜糖蛋白，在人組織巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，可以作為組織中巨噬細(xì)胞的標(biāo)志。該研究結(jié)果顯示，CD68陽性細(xì)胞主要在癌旁組織中表達(dá)，晚期(Ⅲ、Ⅳ期)腫瘤患者癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞的數(shù)量要高于早期(Ⅰ、Ⅱ期)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及侵及胸膜有關(guān)，提示腫瘤周圍浸潤CD68陽性細(xì)胞的數(shù)量與NSCLC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍正常組織中也呈現(xiàn)CD68高表達(dá)，說明癌灶周圍的正常組織已經(jīng)存在炎性浸潤，這與Mantovani等［9］的觀點相符，即腫瘤的存在能夠不斷地募集附近血管中的巨噬細(xì)胞向其靠近，形成利于其發(fā)展轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境。Sica等［5］認(rèn)為腫瘤在形成過程中能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生表型和功能改變，使其轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Lin等［10］認(rèn)為，腫瘤的生長和發(fā)生惡性變是兩個分開的過程，巨噬細(xì)胞被募集至癌前病變部位，啟動血管生成，預(yù)示惡性轉(zhuǎn)變開始，減少這些巨噬細(xì)胞的浸潤能夠減少50%以上血管密度甚至阻止腫瘤發(fā)展到晚期。

轉(zhuǎn)錄因子AP-1是亮氨酸拉鏈蛋白，在哺乳動物中AP-1二聚體主要由Jun和Fos蛋白亞家族組成，Jun蛋白家族包括Jun、Jun-B及Jun-D;Fos蛋白家族成員為Fos、FosB、Fra-1及Fra-2。Jun蛋白可以形成同源二聚體，亦可與Fos或Fras形成更加穩(wěn)定的異源二聚體，而Fos則只能與Jun形成異源二聚體，故可以用c-Jun蛋白的表達(dá)量來反映AP-1的表達(dá)［11］。該研究結(jié)果顯示癌組織中c-Jun的表達(dá)高于癌旁組織和正常組織，提示腫瘤的發(fā)生與AP-1/c-Jun的活化有關(guān);晚期腫瘤患者癌旁組織中c-Jun表達(dá)高于早期，低分化腫瘤組織中的表達(dá)高于高、中分化腫瘤，提示AP-1/c-Jun隨著腫瘤的發(fā)展和惡性程度的增加而增強活化;在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者侵及胸膜的腫瘤中高表達(dá)，提示AP-1/c-Jun與腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這與Tichelaar等［12］從體外實驗得出的結(jié)論一致。Hess等［13］認(rèn)為c-Jun的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)MMPs、u-PA等的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

該研究結(jié)果顯示，在癌旁組織中CD68陽性細(xì)胞數(shù)與c-Jun蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示癌旁組織中巨噬細(xì)胞浸潤可能與c-Jun的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，由此推測TAM可能是通過激活A(yù)P-1/c-Jun來促進(jìn)NSCLC的發(fā)展轉(zhuǎn)移，與Hagemann等［14］的體外實驗結(jié)論相符。該研究為進(jìn)一步探討炎癥促進(jìn)NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制提供了重要的線索。

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Expressions of CD68 and c-Jun proteins in non-small cell lung cancer tissue

LIU Yu，WANG Na，F(xiàn)ENG Feifei，YAN Zhen，WANG Wei，ZHANG Shaofeng，QIN Lijuan，WU Yiming

Department of Occupational Health，college of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

CD68;macrophage;c-Jun;non-small cell lung cancer;chronic inflammation

Aim:To explore the expressions of CD68 and c-Jun proteins in non-small cell lung cancer(NSCLC)，and their relationship with the development of lung cancer.Methods:Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of CD68 and c-Jun proteins in 67 cases of NSCLC samples including cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues，and Spearman rank correlation analysis was used to investigate the correlation of CD68+cell number with the expression of c-Jun protein.Results:CD68+cell number in cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues was 11.8±1.4，97.5±2.5，52.1±1.9，respectively，and there was statistical significance(F=52 334.934，P＜0.001).The mean optical density of c-Jun protein in cancer tissues，adjacent tissues and normal tissues was 0.25±0.03，0.23± 0.02，0.20±0.01，and there was statistical significance(F=91.280，P＜0.001).The CD68+cell number in adjacent tissues was correlated with the TNM stage(F=158.273，P＜0.001)，lymph node metastasis(F=84.985，P＜0.001)and involvement of pleura(F=16.422，P＜0.001).The expression of c-Jun in adjacent tissues was correlated with TNM stage(F=19.319，P＜0.001)，the differentiation of lung cancer(F=33.918，P＜0.001)，lymph node metastasis(F=12.155，P＜0.001)and involvement of pleura(F=8.318，P=0.005).In adjacent tissues CD68+cell number was positiuely correlated with the expression of c-Jun protein(rs=0.519，P＜0.001).Conclusion:Macrophages mainly infiltrated in tumor-adjacent tissues，and they may promote the development and metastasis of NSCLC by activating AP-1.

R734.2

*國家自然科學(xué)基金資助項目 30872095，81001239，81001240

(2011-03-21收稿 責(zé)任編輯趙秋民)