組蛋白去乙?；?在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

陳 琛

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院病理科，河南鄭州450014)

目前，宮頸癌的發(fā)病率居高不下，且預后極差，因此尋找轉(zhuǎn)移相關基因來診斷宮頸癌顯得意義重大。近年來的研究顯示，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2，HDAC2)作為該家族重要的Ⅱ型成員在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用［1－3］。抑制HDAC的活性或表達已經(jīng)成為惡性腫瘤治療的十分有用的分子靶點［4－7］。本研究采用免疫組化和原位雜交(in situ hybridization，ISH)方法聯(lián)合檢測HDAC2在宮頸鱗癌組織及正常宮頸黏膜組織中的表達情況，并分析其表達與宮頸鱗癌的臨床病理學特征的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 80例宮頸鱗癌及25例正常宮頸黏膜組織，均來自于2006年5月至2011年8月鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科手術切除標本。所有宮頸鱗癌患者術前均未服用任何抗腫瘤藥物，均未接受放、化療。80例宮頸鱗癌患者年齡為25～74歲，平均年齡(53.1±12.3)歲，其中年齡 ＜50歲者27例，≥50歲者53例。依據(jù)WHO 1985年腫瘤細胞分化程度規(guī)定，其中高分化癌11例，中分化癌45例，低分化癌24例。依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000)修訂的TNM分期標準，其中Ⅰ期37例，Ⅱ期43例。依據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分類，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例。標本經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4～6 μm，用于 HE、免疫組織化學及原位雜交染色。

1.2 主要試劑及探針合成 預雜交液、SA－Bio－AP、BCIP/NBT均購自武漢博士德生物技術有限公司。探針序列:原位雜交5’端生物素標記、全硫代修飾探針由北京奧科生物技術有限公司合成。HDAC2探針序列:5’－CTAGTCTAAAAGTGGATGA－3’。HDAC2 單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化方法 采用免疫組化S－P法，常規(guī)脫蠟，PBS清洗，抗原修復，體積分數(shù)3%H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗，滴加正常山羊血清封閉，加Ⅰ抗(即用型)，4℃冰箱過夜，PBS清洗，加Ⅱ抗，PBS清洗，加Ⅲ抗，PBS清洗，DAB顯色。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用Novus Biologicals公司提供的切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 ISH方法 標本經(jīng)新鮮配制二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后，用新鮮配制的體積分數(shù)0.5%H2O2室溫處理30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;質(zhì)量分數(shù)3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶(0.01 g/L)，37 ℃，10 min，消化標本DNA結(jié)合蛋白;每張玻片滴加20 μL不含探針的預雜交液(42℃)，預雜交4 h;加含探針(1 ng/L)的雜交液，42℃濕盒內(nèi)雜交12 h;檸檬酸鹽42℃洗后，加 SA－Bio－AP 37 ℃，10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光顯色2～4 h。以不含探針的標本作陰性對照。

1.5 結(jié)果判定 HDAC2蛋白及mRNA陽性信號分別呈黃色及紫藍色顆粒樣物質(zhì)，分別位于細胞核及細胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下隨機選取5個視野(每個視野觀察細胞數(shù)不少于200個)，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結(jié)果判定［8］。采用9分評分制。按照陽性細胞所占百分比:陽性細胞＜10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分;按染色程度強弱:陰性為0分，淡黃(藍)色染色為1分，中度黃(藍)色染色為2分，棕黃(紫藍)色染色為3分。然后將兩項評分的乘積作為總分，總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析，率的比較用χ2檢驗，相關性檢驗用Spearman相關分析，檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HDAC2蛋白表達情況 HDAC2蛋白陽性信號定位于細胞核中，呈淡黃至棕黃色顆粒樣物質(zhì)(圖1)。HDAC2蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率(65.0%)顯著高于正常宮頸黏膜組織(16.0%)(χ2=18.375，P ＜0.001)。不同臨床病理學特征的宮頸鱗癌組織中HDAC2蛋白的表達情況見表1。

圖1 宮頸鱗癌組織中HDAC2蛋白的表達(S－P×400)

2.2 HDAC2 mRNA表達情況 HDAC2 mRNA陽性信號定位于細胞質(zhì)中，呈藍紫色顆粒樣物質(zhì)(圖2)。HDAC2 mRNA在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率(57.5%)顯著高于正常宮頸黏膜組織(8.0%)(χ2=18.807，P ＜0.001)。不同臨床病理學特征的宮頸鱗癌組織中HDAC2 mRNA的表達情況見表1。

圖2 宮頸鱗癌組織中HDAC2 mRNA的表達(ISH×400)

表1 HDAC2蛋白及mRNA表達與宮頸鱗癌臨床病理學特征的關系

2.3 HDAC2蛋白及mRNA在宮頸鱗癌組織中表達的相關性 HDAC2蛋白及mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達呈正相關關系(r=0.482，P ＜0.05)。見表2。

表2 HDAC2蛋白及mRNA表達的相關性分析

3 討論

HDACs是由一組酶組成的，其主要的功能是從ε－N－乙酰賴氨酸中刪除乙?；鶊F。因為真核生物DNA的組織和包裝主要通過核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4的增加來完成，從而形成染色質(zhì)這種復合物的結(jié)構，核心組蛋白的修飾對于染色質(zhì)構象的改變是十分重要的［9－10］。乙?；揭灿绊戅D(zhuǎn)錄的活性:乙?；T導開放的染色質(zhì)構象，這種構象可提高轉(zhuǎn)錄效率。染色質(zhì)的乙?；c轉(zhuǎn)錄活性相關，而去乙?；c基因沉默有關。HDACs也涉及到非組蛋白可逆的乙酰化。有研究顯示，HDAC2在口腔腫瘤組織中均呈現(xiàn)過表達，其過表達與口腔腫瘤的晚期和預后差關系密切［11］。Chang等［12］檢測了 5 株頭頸部腫瘤細胞系Ca9－22、Cal－27、HSC－3、SAS 和 TW2.6 中 HDAC2 的表達，并構建HDAC2的過表達載體和shRNA載體分別研究其表達上調(diào)或下調(diào)對口腔腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除SAS細胞中HDAC2的表達導致腫瘤發(fā)生和進展能力的下降。Fritzsche等［13］在腎癌細胞中發(fā)現(xiàn)了HDAC2的高表達，其表達的陽性率大約為60%，提示HDAC2作為原癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，HDAC2在正常宮頸黏膜組織中蛋白及mRNA表達均較低，在宮頸鱗癌組織中的表達則顯著升高;HDAC2蛋白及mRNA表達與宮頸鱗癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，這就提示HDAC2蛋白及mRNA的過表達是宮頸鱗癌癌變過程中的一個早期事件，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及演進過程有密切的關系。

本研究通過對HDAC2蛋白及mRNA表達情況的相關性分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織中HDAC2蛋白的表達與HDAC2 mRNA的表達呈正相關，提示其蛋白表達與mRNA表達具有一致性。HDAC2蛋白及mRNA的聯(lián)合檢測有助于合理評估患者的病程，給臨床治療方案的合理制定提供有益的參考。

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