分光光度法定量測定煙草葉面分泌物含量研究

張小全，楊志曉，李欽奎，李 偉，楊鐵釗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州450002)

煙草葉面分泌物與煙葉香氣物質(zhì)密切相關(guān)，其含量高低對煙葉香氣質(zhì)量有重要影響［1］.一般而言，煙草葉面分泌物較多，粘性較大，表現(xiàn)出較濃的香味，去除表面分泌物后煙葉香氣和口味明顯減弱.煙草葉面分泌物主要由煙葉表面腺毛的腺頭細胞分泌的萜醇類物質(zhì)與糖酯類物質(zhì)和由煙葉表面細胞分泌的蠟質(zhì)、脂質(zhì)、揮發(fā)性碳氫化合物以及其他復(fù)雜的高分子化合物或簡單的低分子鏈烴物質(zhì)組成［2-3］.大量的研究表明，煙草葉片分泌物的多少受品種、生態(tài)環(huán)境、栽培技術(shù)等多種因素的影響［4-8］.研究不同材料在不同栽培措施下的葉面分泌物產(chǎn)生規(guī)律，將對烤煙新品種選育和優(yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)的實施，提高煙草香氣的質(zhì)和量都具有重要的指導(dǎo)意義.

煙草葉片分泌物的測定方法雖經(jīng)多年探索，但目前國內(nèi)外采用的方法仍主要是用二氯甲烷萃取葉面、GC/MS定性和定量分析葉面分泌物［7-9］，該方法測定時間長，方法繁瑣，且成本高.用有機溶劑萃取，濃縮、干燥后稱量測定的方法需要大量的葉面分泌物，而且該方法復(fù)雜，費時費事，操作中易造成一定的損失，導(dǎo)致定量檢測結(jié)果不夠準確.分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)，具有靈敏度高、操作簡便快速的特點，對于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，無需分離即可檢測出其中所含的微量組分.本文采用分光光度法對葉面分泌物進行定量分析，探討煙草葉面分泌物快速定量測定方法.

1 材料與方法

烤煙品種(系)為 K326、NC89、8541、紅花大金元、鐵把子和香料煙Basma，種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教試驗園區(qū).土壤類型為沙壤土;全氮0.9 g/kg，速效氮56.3 mg/kg;全鉀 13.5 g/kg，速效鉀 124.56 mg/kg;速效磷5.3 mg/kg;有機質(zhì)13.6 g/kg.4月25日移栽，田間管理按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)要求進行.移栽后跟蹤觀察，選擇長勢一致的煙株，從下部可烤葉算起，對第12、13片葉掛牌標記，當(dāng)葉片生長將至工藝成熟期(九成熟)時，采收成熟度一致的葉片用于煙草葉面分泌物提取.

參照韓錦峰等［9］的煙草葉面分泌物的萃取方法.得到的萃取溶液在40℃、常壓情況下濃縮至30 mL，移入50 mL玻璃瓶中，低溫(0℃)避光保存.

將上述待測樣轉(zhuǎn)移并用二氯甲烷定容至50 mL，再稀釋4倍，進行全波長掃描.將UNICO2102-PC紫外-可見分光光度計開機預(yù)熱30 min后，用二氯甲烷作基線、調(diào)零，然后用光程為1 cm的立方石英比色杯盛待測液，加蓋玻璃蓋子，以防二氯甲烷揮發(fā).對待測液在200～1 000 nm波長范圍內(nèi)連續(xù)掃描，每次移動1 nm.分別掃描得到全波長光吸收圖譜，比較確定用于測定標準樣品的適宜波長范圍.

取上述6個煙草基因型的定容后待測液各20 mL混合，用水浴鍋于45℃下充分濃縮成膏狀物，且無二氯甲烷氣味，可得標準樣品，供配制系列濃度梯度的標準樣品溶液.在1/10 000電子天平上稱取濃縮后的膏狀物0.113 5 g，用二氯甲烷定容至100 mL，作母液.分別從母液中移取 0.5、1、2、3、4、5、8 mL，定容于25 mL容量瓶中.在選定波長下測得標準溶液的光密度，制作標準樣品曲線及回歸方程式.

將6個基因型的待測樣剩余部分按照標準溶液的制作方法濃縮后稱質(zhì)量，定容，制得已知濃度的溶液，分別測得光密度，用回歸方程計算其濃度，檢驗回歸方程的誤差范圍.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面分泌物萃取液特征吸收光譜分析

通過比較5個煙草基因型的葉面分泌物萃取液在200～1 000 nm范圍的光吸收圖譜(圖1)可知，各個煙草基因型的葉面分泌物萃取液在紫外光區(qū)均有明顯的吸收單峰，吸收峰穩(wěn)定在235 nm附近，不同煙草類型和不同烤煙基因型間葉面分泌物萃取液吸收峰位變化很小.根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)與光吸收的關(guān)系，在紫外區(qū)產(chǎn)生光吸收的物質(zhì)必須具有不飽和結(jié)構(gòu).煙草葉面分泌物的主要化學(xué)成分萜醇類物質(zhì)具有不飽和結(jié)構(gòu)，與此吸收峰關(guān)系密切.

圖1 不同煙草基因型葉面分泌物萃取液的全波長掃描圖Fig.1 The spectrums of leaf surface glandular exudates of the different tobacco genotypes

2.2 標準樣品溶液回歸方程的建立

以二氯甲烷作對照，將制得的已知濃度的標準溶液在235 nm波長下分別比色，記錄光密度，并以此建立吸收曲線和回歸方程(圖2).該吸收曲線和方程的決定系數(shù)(R2)=0.999 6.不同濃度的分泌物萃取液在該波長下光密度變化靈敏，測得光密度后，用回歸方程計算的濃度與已知濃度的誤差在5%以內(nèi).根據(jù)朗伯-比爾定律，標準樣品的光密度在0.2～0.8范圍內(nèi)，所得的回歸方程線性最好，待測樣品溶液的光密度控制在該范圍內(nèi)，通過回歸方程計算得到的濃度才能很好地和實際濃度吻合.因此確定235 nm的波長作為煙草葉面分泌物萃取液的吸收檢測峰.

圖2 葉面分泌物萃取液的光密度標準曲線和標準回歸方程Fig.2 The absorbency standard curve and the equation of leaf surface glandular exudates

2.3 回歸方程的誤差檢驗

將6個基因型的葉面分泌物萃取物濃縮至膏狀，取部分萃取物稱質(zhì)量，用二氯甲烷溶劑配制成已知濃度的溶液，并且使得溶液的光密度大致在0.2～0.8范圍內(nèi).分別用UNICO2102-PC紫外-可見分光光度計測已知濃度溶液的光密度，并通過回歸方程計算得到相應(yīng)的濃度，計算測得濃度和實際濃度之間的誤差.結(jié)果(表1)表明，由回歸方程得到的濃度和已知濃度的誤差均能控制在5%以內(nèi)，說明通過標準溶液建立回歸曲線和方程，再利用比色值得出溶液濃度的方法是可行的.可以作為定量測定煙草葉面分泌物的一種簡便、準確的方法.

表1 葉面分泌物萃取液和標準回歸方程準確度檢測Tab.1 The veracity testing of the standard curve and the equation of the exudates from tobacco leaf surface glandular

3 結(jié)論

通過煙草不同的類型和基因型的葉面分泌物萃取液的全波長掃描，發(fā)現(xiàn)本試驗各個樣品的最大光密度均在紫外光區(qū)235 nm附近，而且呈單峰曲線，因此較容易確定最大吸收峰位置.用不同濃度的標準溶液在235 nm波長下分別比色，建立標準回歸方程.對12個已知濃度樣本的檢測結(jié)果表明，由回歸方程得到的濃度和已知樣本濃度的誤差均能控制在5%以內(nèi)，說明在該波長下建立的標準回歸方程的準確度能達到定量檢測的要求.

煙草葉面分泌物主要化學(xué)成分為萜醇類物質(zhì)，是煙草的重要致香前體物質(zhì)［4-5］，具有紫外光區(qū)吸收所必需的不飽和結(jié)構(gòu).因而，在紫外光區(qū)235 nm下檢測的葉面分泌物與煙草致香前體物質(zhì)關(guān)系密切.本試驗建立的定量方法檢測出煙葉葉面分泌物的多少，可以反映煙葉表面主要致香前體物質(zhì)的量，但只能代表煙葉香氣的一部分，定量出的物質(zhì)對煙葉總體香氣的貢獻和影響有多大，還有待進一步研究.

用分光光度法對葉面分泌物進行定量檢測，可實現(xiàn)煙草葉面分泌物的簡便、快速、低成本、大批量、有效定量測定，為利用葉面分泌物指標進行高香氣煙草新品種選育和優(yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)研究奠定基礎(chǔ).

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