氣相色譜法測定牛奶中二嗪農(nóng)殘留量

敖 然，曾振靈，余靜賢，沈祥廣

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

二嗪農(nóng)是少數(shù)允許在獸醫(yī)上使用的有機(jī)磷農(nóng)藥中的一種.在畜牧業(yè)上，二嗪農(nóng)主要用于防治牛、羊、豬的螨、蠅、虱、蜱等體外寄生蟲病.我國和歐盟對二嗪農(nóng)在奶中規(guī)定了停藥期(棄奶期3 d)和最大殘留限量(MRLs 20 μg·kg－1).目前，國內(nèi)用于監(jiān)測二嗪農(nóng)殘留的檢測方法主要集中在蔬菜、水果、肉食品等方面，檢測牛奶中二嗪農(nóng)殘留的文獻(xiàn)報道較少，尚未有專門用于測定奶中二嗪農(nóng)殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).國內(nèi)外有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有液相色譜 － 質(zhì)譜聯(lián)用法［1］、薄層色譜法［2］、氣相色譜法［3］、氣相色譜 － 質(zhì)譜聯(lián)用法［4］等.采用氣相色譜法結(jié)合火焰光度檢測器(FPD)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn).此外氣相色譜儀的儀器價位較低，幾乎在全國各級農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測機(jī)構(gòu)和奶業(yè)企業(yè)均已普及.牛奶是一種比較理想的完全營養(yǎng)食品，已經(jīng)成為大眾飲食中不可缺少的一部分，它的安全和品質(zhì)關(guān)系到廣大民眾的身體健康.該方法的建立將有利于奶業(yè)企業(yè)對原料奶的采購和產(chǎn)品的生產(chǎn)過程進(jìn)行在線檢測，也有利于基層農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測機(jī)構(gòu)就近對奶業(yè)企業(yè)及市場奶品的產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行有效監(jiān)督.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)品(德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號:C12210000，純度97.5%);乙腈、丙酮、正己烷均為國產(chǎn)分析純;中性氧化鋁固相萃取柱.

1.2 儀器

Autosystem XL GC氣相色譜儀，配火焰光度檢測器(FPD)為美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品;J-25型冷凍高速離心機(jī)為德國Baeckman公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;氮吹儀;KS501 digital軌道式搖床為德國 Hettich公司產(chǎn)品;分析天平(感量0.00001 g).

1.3 試液配制

二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)貯備液:準(zhǔn)確稱取0.01026 g二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL容量瓶，用丙酮定容成為100 mg·L－1的二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)貯備液.

二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)溶液:根據(jù)需要精密吸取二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用丙酮稀釋成質(zhì)量濃度分別為20、50、100、500、1000、2000 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.4 色譜條件

色譜柱:DB-17石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm).不分流進(jìn)樣.柱溫程序:初始溫度100℃，保持5 min，以 30℃·min－1升至 260℃，保持 6 min;進(jìn)樣口溫度250℃;檢測器溫度 250℃;載氣(氮?dú)?，純度?99.999%)2.5 mL·min－1;燃?xì)?氫氣)70 mL·min－1;助燃?xì)?空氣)100 mL·min－1;進(jìn)樣量 2 μL.

1.5 樣品的處理

1.5.1 樣品的提取 稱取牛奶10 g(精確至0.01 g)，置于 50 mL聚丙烯塑料離心管中，加丙酮 10 mL，搖勻，加入正己烷20 mL，蓋緊，置搖床振蕩 20 min，8000 r·min－1離心 10 min，上清液移入梨形瓶中，再往離心管中加入20 mL正己烷，重復(fù)上述提取步驟，上清液并入同一梨形瓶中，50℃減壓蒸干.

1.5.2 樣品的凈化 取中性氧化鋁固相萃取柱，加5 mL乙腈平衡，抽干;用5 mL乙腈渦旋溶解梨形瓶蒸干后的殘留物，過柱，加2 mL乙腈洗柱，抽干，收集過柱液和洗柱液于10 mL玻璃的離心管中，置50℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，? mL丙酮溶解吹干殘留物，進(jìn)氣相色譜儀分析.

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 二嗪農(nóng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取相應(yīng)質(zhì)量濃度下的二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL溶解空白牛奶樣品處理后的殘留物，制得該質(zhì)量濃度下的二嗪農(nóng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)氣相色譜儀分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶中二嗪農(nóng)的線性關(guān)系

取適量相應(yīng)濃度二嗪農(nóng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在“1.4”所述色譜條件下，二嗪農(nóng)保留時間約9.8 min.以二嗪農(nóng)的濃度對峰面積作線性回歸，線性方程為Y=0.015X－1.630，r=0.9999，式中Y表示二嗪農(nóng)質(zhì)量濃度(μg·L－1)，X表示相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，r表示相關(guān)系數(shù).二嗪農(nóng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白牛奶樣品和空白牛奶添加樣品的色譜分析結(jié)果見圖1.

圖1 二嗪農(nóng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 μg·mL－1，a)、空白牛奶樣品(b)及空白牛奶添加樣品(10 μg·kg－1，c)的氣相色譜圖Fig.1 Chromatogram of diazinon matrix standard solution(0.1 μg·mL －1，a)，blank milk sample(b)and blank milk with diazinon sample(10 μg·kg－1，c)

2.2 檢測限

本方法的檢測限采用空白牛奶樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行實(shí)際測試，分別在 2.0、5.0 μg·kg－1水平進(jìn)行測試，每批每一質(zhì)量濃度重復(fù)測定5次，分別計算二嗪農(nóng)峰高/噪音(S/N)比值，共進(jìn)行4批次，結(jié)果質(zhì)量濃度為2.0 μg·kg－1的平均S/N為4.04 ±0.72(n=20);質(zhì)量濃度為 5.0 μg·kg－1的平均 S/N 為11.4±1.02(n=20).確定了方法中二嗪農(nóng)檢測限為2.0 μg·kg－1(S/N≥ 3)，定量限為 5.0 μg·kg－1(S/N≥10).

2.3 回收率及變異系數(shù)

采用空白牛奶樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，對方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行測試.將適量不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液各加入10 g空白牛奶樣品中，制得 5、10和 20 μg·kg－13 個添加水平的樣品，然后按樣品處理方法處理，進(jìn)行色譜分析.每一批樣品均測定5次，共4批樣品.二嗪農(nóng)的回收率及變異系數(shù)見表1.

表1 牛奶中二嗪農(nóng)不同質(zhì)量濃度的回收率和變異系數(shù)Tab.1 Recoveries and RSD of diazinon in milk at different concentrations

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

二嗪農(nóng)是一種極性相對較小的脂溶性有機(jī)磷農(nóng)藥，經(jīng)試驗(yàn)，采用硫磷檢測器(FPD)和中等弱極性的毛細(xì)管色譜柱(DB—17型號)進(jìn)行分析對其具有較好的選擇性和靈敏度.檢測器溫度控制在250℃時，二嗪農(nóng)的響應(yīng)峰較高，溫度上升，峰高有下降的趨勢.在本試驗(yàn)所用柱溫程序條件下二嗪農(nóng)的色譜峰寬較窄，峰形高而對稱，空白牛奶試樣在二嗪農(nóng)色譜峰的保留時間附近無雜質(zhì)峰干擾.進(jìn)樣室溫度設(shè)置為250℃，有利于被測物質(zhì)有效氣化，同時防止其在進(jìn)樣室蓄積而干擾檢測，進(jìn)樣室溫度下降或者升高，藥物的色譜峰峰高均有下降的趨勢.

3.2 樣品處理方法的選擇

3.2.1 提取與凈化 比較了極性較大的有機(jī)溶劑(乙腈、丙酮或乙醇等)［5－6］、極性較弱的有機(jī)溶劑(正己烷、乙酸乙酯或石油醚等)［7－9］來提取牛奶中的二嗪農(nóng).因?yàn)檎和榈姆悬c(diǎn)低，極性弱，提取后攜帶的雜質(zhì)少，對提取二嗪農(nóng)有良好的選擇性;同時由于提取后的溶劑含水量很低，易于蒸餾濃縮，最終采用正己烷為提取溶劑.因牛奶中含有乳化成分，容易使正己烷被乳化，所以在10 g牛奶中先加入10 mL丙酮，使蛋白質(zhì)變性，同時破壞乳化.

牛奶中含有乳脂，用正己烷提取后同時也帶入了脂肪，常用液液萃取或固相萃取方法進(jìn)行凈化［10－11］.由于選用正己烷為提取溶劑，不宜采用液液萃取的方法除脂肪，故選用固相萃取法.經(jīng)對氧化鋁柱、C18柱、HLB柱和陽離子交換柱(SCX、MCX)等進(jìn)行比較，使用1 g規(guī)格的中性氧化鋁固相萃取柱能較好去除脂肪，操作簡便，二嗪農(nóng)的回收率也較高，使用2 g規(guī)格的中性氧化鋁固相萃取柱，能更好去除脂肪，但回收率有所下降(約5%).

3.2.2 基質(zhì)效應(yīng) 據(jù)文獻(xiàn)報道，關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥在蔬菜、水果、肉類等食品中殘留的氣相法檢測試驗(yàn)中，樣品基質(zhì)對許多有機(jī)磷農(nóng)藥色譜峰的響應(yīng)值有增強(qiáng)效應(yīng)［12－13］.在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同一濃度下，含基質(zhì)的二嗪農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積約是用純丙酮配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積的1.5倍.因此，檢測結(jié)果的計算采用歐盟推薦的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)法計算［14］，以抵消基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的干擾.

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