日糧中添加酶解小麥蛋白對南美白對蝦生長及非特異性免疫功能的影響

許合金，馮 幼，王修啟，張子峰

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642;2 廣東粵海飼料集團，廣東湛江 524017;3 鄭州新威營養(yǎng)技術(shù)有限公司，河南鄭州 450000）

近年來，隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，引起養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，病害頻繁發(fā)生，導(dǎo)致成活率過低，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失.因此，如何提高對蝦成活率及免疫機能是目前對蝦養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題.小麥蛋白俗稱谷朊粉，又稱活性面筋蛋白，主要由富含谷氨酸和脯氨酸的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成［1－2］.酶解小麥蛋白(Hydrolyzed wheat gluten，HWG)是根據(jù)小麥蛋白質(zhì)的特性，經(jīng)獨特的生物技術(shù)采用多種酶協(xié)同作用制成的一種無抗原植物性蛋白源，不僅含有免疫調(diào)節(jié)肽、抗菌肽等多種免疫活性肽，而且還富含谷氨酰胺(肽)［3－4］，可作為動物補充谷氨酰胺(肽)的優(yōu)質(zhì)原料來源.在羅非魚Oreochromis niloticus和哲羅魚Hucho taimen上的研究顯示，飼料中添加谷氨酰胺(肽)有提高成活率的功效［5－6］.楊小軍［7］研究發(fā)現(xiàn)，HWG 能夠顯著促進免疫器官的生長、增強巨噬細胞吞噬能力、提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖，對于免疫功能能夠起到重要的調(diào)節(jié)作用.然而，目前有關(guān)HWG研究模型主要集中于鼠、雞，而對南美白對蝦Litopenaeus vannamei的研究報道較少.作為富含多種免疫活性肽及谷氨酰胺(肽)的HWG，是否會對南美白對蝦的免疫力和生長性能尤其是成活率產(chǎn)生顯著影響?一直是人們關(guān)注的問題.本試驗擬通過日糧中添加不同比例的HWG，觀察其對南美白對蝦免疫機能及生長性能尤其是成活率的影響，旨在為HWG在南美白對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗蝦由廣東某蝦場提供;酶解小麥蛋白(HWG)由鄭州新威營養(yǎng)技術(shù)有限公司提供，營養(yǎng)成分見表1，HWG中谷氨酰胺含量測定參考文獻［8－9］方法進行，其他氨基酸含量及肽相對分子質(zhì)量分布的檢測參考 Wang等［4，10］方法進行.HWG 添加方式(模擬實際生產(chǎn)工藝):先與基礎(chǔ)日糧超微粉(過80目篩)通過V型混合機充分混勻，接著添加油脂和水在圓桶式攪拌機中繼續(xù)混合均勻，通過擠條機壓制成條狀飼料，然后通過一系列烘箱熟化、干燥、冷卻、破碎機等制成顆粒試驗飼料.

表1 酶解小麥蛋白主要成分及相對分子質(zhì)量分布Tab.1 Ingredients and relative molecule mass distribution of HWG

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 選用健康狀況良好、個體均勻的南美白對蝦750尾，隨機分為5個處理組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)50尾，各重復(fù)平均體質(zhì)量不存在差異，飼養(yǎng)于水族箱內(nèi).處理1:對照組(基礎(chǔ)日糧);處理2:0.05%HWG組(基礎(chǔ)日糧+0.05%HWG);處理3:0.10%HWG組(基礎(chǔ)日糧+0.10%HWG);處理4:0.15%HWG組(基礎(chǔ)日糧+0.15%HWG);處理5:0.20%HWG組(基礎(chǔ)日糧+0.20%HWG).基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2.每天按體質(zhì)量的8%～10%投餌，分4次定時、定量投喂，每天換水、清污，記錄采食量，試驗期為53 d.

1.2.2 生產(chǎn)性能測定 試驗?zāi)┢诜Q質(zhì)量，計數(shù).計算成活率、餌料系數(shù)、增質(zhì)量率以及特定生長率.計算公式:成活率(Survival rate，SR)=(試驗結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗開始時投放的蝦尾數(shù))×100%;餌料系數(shù)(Feed conversion rate，F(xiàn)CR)=飼料攝入量/(終末體質(zhì)量－初始體質(zhì)量);增質(zhì)量率(Mass gain rate，MGR)=(終末體質(zhì)量－初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%;特定生長率(Specific growth rate，SGR)=(ln終末平均體質(zhì)量－ln初始平均體質(zhì)量)/飼養(yǎng)時間(d)×100%.

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分Tab.2 Ingredient and nutritional composition of the basic diet

1.2.3 血清免疫指標(biāo)測定 在試驗結(jié)束當(dāng)天，每個重復(fù)選取20尾蝦進行血樣采集.取血時用1 mL一次性注射器自蝦頭胸甲后插入心臟抽取血液，然后置于無菌的Eppendorf管中，2500 r/min 4℃離心10 min，收集上清液用于酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)指標(biāo)測定，PO的酶活性以L－dopa 為底物，參考 Ashida［11］的方法進行測定，SOD和LSZ的測定方法參照南京建成生物工程研究所試劑盒進行.

1.2.4 肝胰腺免疫指標(biāo)測定 在試驗結(jié)束的當(dāng)天，每重復(fù)選取5尾蝦進行肝胰腺采集，合并后放置于－80℃冰箱冷藏待用.分析時，將肝胰腺樣品取出，稱取一定質(zhì)量后，按照9倍體積(m∶V)加入提前在0℃冰箱中預(yù)冷的0.1 mol/L pH6.4的磷酸緩沖液稀釋，在冰浴中用勻漿器勻漿，將勻漿液在0℃、2500 r/min離心 10 min后，取上清液，用于 PO、SOD、LSZ、谷光甘肽過氧化酶(GSH－PX)、堿性磷酸酶(ALP)和丙二醛(MDA)指標(biāo)測定.PO活性參考Ashida［11］的方法進行，SOD、LSZ、GSH－PX、ALP、MDA以及勻漿液中總蛋白含量測定和計算方法參照南京建成生物工程試劑盒進行.

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用 SPSS 17.0分析軟件 One－way ANOVA模型來分析，多重比較采用LSD法，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.

2 結(jié)果

2.1 酶解小麥蛋白對南美白對蝦生長性能的影響

由表3可知，0.05%、0.15%和0.20%HWG組南美白對蝦的增質(zhì)量率與對照組相比數(shù)值上分別提高了10.23%、7.21%和2.69%，0.15%HWG組顯著高于0.10%HWG組(P＜0.05).在整個試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，HWG組南美白對蝦的成活率均高于對照組，其中0.20%HWG組與對照組相比高出8個百分點(P＜0.05).0.15%HWG組餌料系數(shù)與對照組相比有下降的趨勢(P=0.07)，0.10%HWG組顯著高于0.15%HWG組(P＜0.05).

表3 酶解小麥蛋白對南美白對蝦生長性能的影響1)Tab.3 Effects of dietary HWG supplementation on growth performance1)

2.2 酶解小麥蛋白對南美白對蝦血清酶活性的影響

由表4可知，日糧中添加HWG后蝦血清中PO活性較對照組高，但各組間差異不顯著(P＞0.05).其中0.15%HWG組活性最高.對照組SOD活性最高，各組間無顯著性差異(P＞0.05).0.20%HWG組LSZ活性顯著高于0.05%HWG組(P＜0.05)，對照組與HWG組間無顯著性差異(P＞0.05).

表4 酶解小麥蛋白對南美白對蝦血清酶活性的影響1)Tab.4 Effects of dietary HWG supplementation on biochemical indexes of haemolymph

2.3 酶解小麥蛋白對南美白對蝦肝胰腺酶活性的影響

由表5可知，0.10%HWG組和0.15%HWG組SOD活性與對照組相比數(shù)值上分別提高了26.79%和20.19%.LSZ活性對照組最低，0.20%HWG組最高，各組之間差異不顯著(P＞0.05).0.15%HWG組和0.20%HWG組 GSH－PX活性顯著高于0.05%HWG組(P＜0.05)，0.20%HWG組與對照組相比也有提高的趨勢(P=0.09).對照組肝胰腺中MDA含量最高，0.20%HWG組最低，各組間差異不顯著(P＞0.05).

表5 酶解小麥蛋白對南美白對蝦肝胰腺酶活性的影響1)Tab.5 Effects of dietary HWG supplementation on biochemical indexes of hepatopancreases1)

3 討論與結(jié)論

3.1 酶解小麥蛋白對南美白對蝦生長性能的影響

成活率反映生產(chǎn)性能，是決定養(yǎng)殖效益的關(guān)鍵指標(biāo)之一.本研究結(jié)果顯示，添加HWG組南美白對蝦成活率均高于對照組，且隨著日糧中HWG添加量的增加而增加，其中0.20%HWG組與對照組之間差異顯著(P＜0.05).我們推測HWG提高南美白對蝦的成活率可能跟HWG富含谷氨酰胺(肽)等小肽有關(guān).徐奇友等［12］研究表明，日糧中添加谷氨酰胺(肽)可顯著提高哲羅魚仔魚腸道Na+/K+－ATPase活性，這與Yan等［13］在幼建鯉魚 Crpinus carpio var.jian上研究結(jié)果相類似.葉均安等［14］研究結(jié)果顯示，日糧中添加谷氨酰胺(肽)可顯著增加日本對蝦Marsupenaeus japonicus腸道絨毛高度.徐奇友等［12］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加谷氨酰胺(肽)日糧的哲羅魚仔魚腸道蛋白酶、脂肪酶的酶活性顯著高于對照組.此外，本試驗所用HWG相對分子質(zhì)量在500以下的蛋白占 37.62%，相對分子質(zhì)量為 500～2000占28.14%.水產(chǎn)動物消化道分化簡單，消化道較短，腸道內(nèi)酶數(shù)量和轉(zhuǎn)運載體數(shù)量相對較少，這些小分子肽一方面可消除與游離氨基酸的吸收競爭，促進游離氨基酸的吸收，提高氨基酸特別是一些共用氨基酸轉(zhuǎn)運載體的氨基酸的利用率;另一方面，這些小分子肽還可能直接參與蛋白質(zhì)合成，提高蛋白質(zhì)沉積率;再者，這些小分子肽還可能與某些礦物元素結(jié)合，通過提高這些礦物元素的溶解度，從而提高它們的吸收率［15］.這提示HWG中小肽可能通過上述方式來促進動物腸道發(fā)育，加速絨毛生長，提高消化酶活性以及機體消化、吸收功能，從而提高生產(chǎn)性能.這與本研究中 0.05%HWG、0.15%HWG以及0.20%HWG組的增質(zhì)量率、特定生長率均高于對照組的結(jié)果基本一致，并且0.15%HWG組與對照組相比有降低餌料系數(shù)的趨勢(P=0.07).雖然，HWG對提高哺乳動物如小鼠、大鼠和豬的平均日增質(zhì)量、平均日采食量效果顯著［16－18］，但在哺乳動物上得到的結(jié)果并不能反映蝦上的情況，畢竟甲殼動物跟哺乳動物消化系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)有所不同，這也可能是HWG對提高蝦生產(chǎn)性能效果沒有哺乳動物顯著的原因之一.

3.2 酶解小麥蛋白對南美白對蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響

小麥蛋白在酶解過程中通常伴隨有重要結(jié)構(gòu)的重排，釋放出許多如谷氨酰胺(肽)、免疫調(diào)節(jié)肽以及阿片肽等生物活性肽［3－4，19－20］以及抗氧化活性物質(zhì)［21－22］，日糧中添加HWG可在不同程度上提高動物機體免疫機能.方娜等［23］用含HWG的日糧連續(xù)飼喂小鼠28 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HWG能夠顯著提高血清中GSH－PX、IgM 和 IgG 的水平.周亞飛［24］的研究結(jié)果表明，小麥蛋白酶解物能夠不同程度提高AA肉雞脾臟、胸腺和法氏囊等免疫器官的質(zhì)量，各免疫器官指數(shù)也有不同程度的提高.

與脊椎動物不同，對蝦在抵抗入侵的病原微生物過程中，不是由免疫球蛋白介導(dǎo)的特異性免疫系統(tǒng)來清除異物，而是依靠非特異性免疫系統(tǒng)來完成.該系統(tǒng)由參與免疫反應(yīng)的血淋巴細胞和體液因子組成.相對于細胞免疫而言，蝦類的體液免疫研究要多一些.通常將體液中的PO、LSZ、GSH－PX和MDA等酶活力作為衡量對蝦免疫活力高低的參照指標(biāo).

在本試驗中，除0.20%HWG組肝胰腺GSH－PX活性與對照組相比有下降趨勢外(P=0.09)，0.10%HWG組和0.15%HWG組SOD活性與對照組相比數(shù)值上雖然分別提高了26.79%和20.19%，但差異不顯著.血清中各組之間酶活性也無顯著性差異(P＞0.05).目前關(guān)于HWG對南美白對蝦體內(nèi)免疫酶活性影響的報道不多，推測上述試驗結(jié)果產(chǎn)生的原因可能跟南美白對蝦自身健康狀況有關(guān).成活率不僅是反映生產(chǎn)性能的一個關(guān)鍵指標(biāo)，同時還可作為蝦群健康狀況的參考.從本次試驗生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)看，雖然成活率隨HWG添加量的增加而增加，但最低的那一組即對照組也有92%的成活率，說明在本次試驗過程中南美白對蝦整體健康狀況比較好，而且試驗是在養(yǎng)殖基地的室內(nèi)進行，養(yǎng)殖環(huán)境較室外的好，這就在一定程度上掩蓋了HWG提高免疫機能的功效，這也提示在較為惡劣養(yǎng)殖環(huán)境下使用HWG可能會起到較好的效果.

本試驗結(jié)果表明，在南美白對蝦日糧中添加酶解小麥蛋白能夠提高對蝦成活率，有降低餌料系數(shù)和改善免疫機能的趨勢，這些結(jié)果為酶解小麥蛋白在蝦飼料中的應(yīng)用提供初步參考，其最佳添加劑量和作用機制尚待進一步研究.

［1］彭海萍，彭鳳霞.可食性小麥蛋白膜的研究［J］.現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2003(3):42－44.

［2］王章存，康艷玲，王紹鋒.谷朊粉研究進展［J］.糧食與油脂，2006(6):3－5.

［3］ZIOUDROU C，STREATY R A，KLEE W A.Opioid peptides derived from food proteins［J］.Journal of Biological Chemistry，1979，254(7):2446－2449.

［4］WANG Jin－shui，ZHAO Mou－ming，ZHAO Qiang－zhong，et al.Characterization of hydrolysates derived from enzymatic hydrolysis of wheat gluten［J］.Journal of Food Science，2007，72(2):103－107.

［5］楊奇慧，周岐存，譚北平，等.谷氨酰胺對雜交羅非魚生長、飼料利用及抗病力的影響［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15(6):1016－1023.

［6］徐奇友，王常安，許紅，等.丙氨酰－谷氨酰胺對哲羅魚仔魚生長和抗氧化能力的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2009，21(6):1012－1017.

［7］楊小軍.灌喂大豆蛋白、面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物對大鼠免疫功能的影響［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，2003.

［8］劉文萍.HPLC法測定甘氨酰－L－谷氨酰胺有關(guān)物質(zhì)［J］. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，5(11):42－43.

［9］周榮艷.飼料中谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺的測定［J］. 飼料研究，2004(1):30－32.

［10］WANG Jing－shui，ZHAO Mou－ming，BAO Yang，et al.Preparation and characterization of modified wheat gluten by enzymatic hydrolysis－ultrafiltration［J］.Journal of Food Biochemistry，2008，32(3):316－334.

［11］ASHIDA M.Purification and characterization of prophenoloxidase from hemolymph of the silkworm Bombyx mori［J］.Archs Biochem Biophys，1971，144:749－762.

［12］徐奇友，王常安，許 紅，等.飼料中添加谷氨酰胺二肽對哲羅魚仔魚腸道抗氧化活性及消化吸收能力的影響［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2010，17(2):351－356.

［13］YAN Lin，ZHOU Xiao－qiu.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.jian)［J］.Aquaculture，2006，256:389－394.

［14］葉均安，王冰心，孫紅霞，等.谷氨酰胺二肽對日本對蝦血清生化指標(biāo)、肝胰腺細胞凋亡及腸粘膜形態(tài)的影響［J］. 海洋與湖沼，2009，40(3):347－352.

［15］明建華，劉波，劉文斌.小肽吸收機制極其在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2008(4):44－47.

［16］洪瑾芳.酶解小麥蛋白對熱應(yīng)激小鼠生理功能的影響［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，2009.

［17］楊小軍，左偉勇，陳偉華，等.面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物對大鼠免疫功能的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27(4):69－72.

［18］RICHERT B T，HANCOCK J D，MORRILL J L.Effects of replacing milk and soybean products with wheat glutens on digestibility of nutrients and growth performance in nursery pigs［J］.Journal of Animal Science，1994，72:151－159.

［19］王修啟，張兆敏，閻祥洲，等.麥谷蛋白源外啡肽研究進展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(1):75－78.

［20］張亞飛.小麥蛋白Alcalase水解物中免疫活性肽的研究［D］.無錫:江南大學(xué)食品學(xué)院，2006.

［21］黃達明，張玲，管國強，等.谷朊粉活性肽的分離及其抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，4(31):108－110.

［22］郭紅英.麥胚蛋白酶解物的制備極其抗氧化功能研究［D］.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，2009.

［23］方娜，王衛(wèi)國.谷朊粉酶解物對小鼠免疫功能的影響［J］. 糧食與飼料工業(yè)，2009(5):37－38.

［24］周亞飛.面筋蛋白酶解物調(diào)節(jié)肉雞免疫器官及ND抗體水平的研究［J］. 動物醫(yī)學(xué)進展，2006，27(3):65－68.