SP-A在急性壞死性胰腺炎肺損傷大鼠的表達(dá)和意義

陳 瑜,黃中偉,沈雁波

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院急診內(nèi)科,江蘇南通226001)

急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)是一種病情進(jìn)展迅速,易累及肺、肝、腎、心臟等全身多個(gè)臟器,導(dǎo)致全身多臟器功能衰竭(multiple organ disfuction syndrome,MOF)的預(yù)后兇險(xiǎn)性疾病[1]。而急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是ANP早期最常見的并發(fā)癥[2],以及最主要的死亡原因之一。肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(pulmonary surfactant associated protein A,SP-A)是反映ALI的早期指標(biāo),本研究通過構(gòu)建ANP并發(fā)ALI的動物模型,觀察SP-A等相關(guān)指標(biāo)的變化,探討SP-A在ANP并發(fā)ALI發(fā)病中的意義及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取健康成年大鼠(sprague-dawley,SD)100只(體質(zhì)量220～250 kg,兩月齡左右,雌雄不拘,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),隨機(jī)分成假手術(shù)組(SO組)和模型組(ANP組),各組又分別隨機(jī)分為 6、12、24、36、48 h 組,每組 10 只。

1.2 模型制備 參照Lankish和Ibse[3]的方法,SD術(shù)前禁食12 h,不禁水,腹腔注射10%水合氯醛(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)300 mg/kg麻醉SD后,固定于手術(shù)臺,腹部皮膚常規(guī)消毒,正中切口入腹,于十二指腸內(nèi)側(cè)可見片狀分布的胰腺,找到胰膽管,胰膽管十二指腸開口處用無損傷金屬夾夾閉,41/2號輸液針頭向十二指腸開口方向插入胰膽管,以0.1 mL/min速度向胰膽管內(nèi)注入4%牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司),劑量為1 mL/kg,注射完畢后保持3 min,至胰腺組織出現(xiàn)肉眼可見的水腫、出血變化后,解除胰膽管上下阻斷,拔出穿刺針,分層關(guān)腹,即制成ANP并發(fā) ALI SD模型,麻醉蘇醒后,自由飲水,禁食,保持室溫23～26℃,SO組步驟同ANP組,推注0.9%生理鹽水,劑量為1 mL/kg。

1.3 指標(biāo)檢測 分別于制模后6、12、24、36、48 h將 SD麻醉剖腹,心臟穿刺抽取2～3 mL血液注入試管,室溫下3 000 r/min離心20 min后留取血清,置于-80℃冰箱中保存待檢;放血處死后,取SD的左肺,用生理鹽水2 mL行支氣管肺泡灌洗2次,取回收的肺泡灌洗液(BALF)2 mL注入試管,室溫下2 500 r/min離心10 min后留取上清液,置于-80℃冰箱中保存待檢,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清SP-A濃度和BALF中SP-A濃度(SP-A試劑由上海亞培生物科技有限公司提供)。取SD的右肺中葉組織,濾紙吸干表面水分,用電子分析天平稱濕質(zhì)量(W),然后在80℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤24 h,質(zhì)量恒定后稱干質(zhì)量(D),計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比値(W/D)。同時(shí)快速切取胰腺、肺組織,置于4%多聚甲醛(南京大唐化工有限責(zé)任公司)中固定,用石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以±s表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SD一般情況 ANP組,6 h組SD少動,腹腔積液較少;12 h組SD出現(xiàn)呼吸急促,活動減少,開始有血性腹腔積液;24～48 h內(nèi)可見SD喘息明顯,血性腹腔積液增多。發(fā)紺進(jìn)行性加重,24～36 h內(nèi)1只死亡(表 1)。隨著時(shí)間推移,SD呈現(xiàn)嚴(yán)重呼吸窘迫表現(xiàn),36～48 h內(nèi)1只死亡。SO組SD無明顯呼吸困難,3 h活動靈敏;6～48 h攝入食、水無明顯異常,無死亡發(fā)生。兩組術(shù)后不同時(shí)間肺組織W/D、血清 SP-A濃度、BALF中SP-A濃度測定見表1。

表1 兩組術(shù)后不同時(shí)間肺組織W/D、血清SP-A濃度、BALF中SP-A濃度測定值比較(±s)

表1 兩組術(shù)后不同時(shí)間肺組織W/D、血清SP-A濃度、BALF中SP-A濃度測定值比較(±s)

*:P＜0.01,與ANP組比較;a:24～36 h和 36～48 h各1只SD死亡。

時(shí)間(h) 檢測指標(biāo) n SO組 n ANP組6 W/D 10 2.57±0.15* 10 4.44±0.19血清SP-A(ng/mL)10 0.02±0.01* 10 0.22±0.02 BALF SP-A(ng/mL)10 2.63±0.38* 10 1.52±0.13 12 W/D 10 2.45±0.12* 10 4.66±0.11血清SP-A(ng/mL)10 0.03±0.01* 10 0.24±0.01 BALF SP-A(ng/mL)10 2.49±0.05* 10 1.63±0.14 24 W/D 10 2.54±0.13* 10 4.83±0.10血清SP-A(ng/mL)10 0.03±0.01* 10 0.27±0.03 BALFSP-A(ng/mL)10 2.51±0.00 10 1.43±0.06 36 W/D 10 2.47±0.20* 9a 4.96±0.11血清SP-A(ng/mL)10 0.03±0.01* 9a0.292±0.02 BALF SP-A(n/mL)10 2.53±0.16* 9a 1.14±0.07 48 W/D 10 2.54±0.10* 8a 5.07±0.14血清SP-A(ng/mL)10 0.02±0.01* 8a0.260±0.02 BALF SP-A(ng/mL)10 2.44±0.13* 8a 0.93±0.06

2.2 胰腺組織的顯微鏡觀察 SO組SD早期可見部分間質(zhì)水腫,極少量的炎性細(xì)胞浸潤,偶見點(diǎn)狀出血,未見腺泡細(xì)胞壞死。ANP組SD術(shù)后6 h可見明顯小葉間水腫,片狀出血,炎性細(xì)胞浸潤,部分腺泡細(xì)胞變性;術(shù)后12～48 h可見大量炎性細(xì)胞浸潤,片狀出血,胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞,大量腺泡細(xì)胞壞死明顯(封2圖1)。

2.3 肺組織的顯微鏡觀察 SO組各時(shí)間點(diǎn)SD肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。ANP組6 h見SD肺間質(zhì)水腫、充血,12 h后隨著時(shí)間的延長,肺病理改變逐漸加重呈不同程度的肺泡和間質(zhì)水腫、出血,肺泡間隔增寬,大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂等典型的ALI病理改變(封3圖2)。

3 討 論

急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(acute pancreatitis-associated lung injury,APALI)發(fā)生機(jī)制仍不很清楚。有研究認(rèn)為ALI主要機(jī)制在于肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant,PS)發(fā)生改變,導(dǎo)致肺微血管通透性增高,使組織間隙中富含蛋白質(zhì)的液體大量滲入,引起肺水腫[4-5]。而SP-A為PS的一種重要組成成分[6],其分布于肺泡氣液界面,起到抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡、防止肺泡萎陷和肺不張的作用[7-8]。由于SP-A極大部分在肺內(nèi)合成與分泌,肺外組織極少表達(dá)[9],因而SP-A的合成與分泌有一定的肺部特異性。

在本研究中,ANP組肺W/D逐漸增加(表1),提示肺泡毛細(xì)血管損傷加重[10],通透性增加,SP-A可通過受損的毛細(xì)血管膜進(jìn)入血液循環(huán),使血清中SP-A濃度增高,而BALF中SP-A濃度進(jìn)一步降低[11],從而在一定時(shí)間點(diǎn)ANP組血清SPA濃度與BALF中SP-A濃度呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證明此理論(表1)。有研究證明,BALF中SP-A的濃度減少程度與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。而與反復(fù)多次支氣管灌洗測定SP-A濃度相比,采用操作簡單的ELISA法檢測血清SP-A濃度,其快捷,方便,無創(chuàng),更易被臨床所接受。因此,血清SP-A水平可以作為反映肺損傷程度特異性指標(biāo)之一[12],適合于臨床應(yīng)用。

綜上所述,血清SP-A濃度的增高及BALF中SP-A濃度減少程度與APALI病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),從而推測可通過檢測血清SP-A濃度來早期診斷APALI。

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